ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПСИХОТРОПНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

ВВЕДЕНИЕ

Психотропные лекарственные средства широко используются в медицинской практике. Большинство лекарственных веществ данной группы препаратов часто встречаются в практике химико-токсикологического анализа

⦁ поэтому представляют большой интерес.

⦁ данной группе препаратов можно отнести снотворные, нейролептики,

транквилизаторы и др. Многие психотропные лекарственные препараты, представленные на мировом рынке, находятся под международным контролем Конвенции психотропных веществ от 1971 г.

Большинство психотропных препаратов обладают кумулятивными свойствами и длительно выводятся из организма, поэтому отравления могут наблюдаться при приеме обычных терапевтических доз. Сочетание психотропных препаратов, а также алкоголь усиливает их действие на организм и представляет большую опасность для здоровья. Клиника течения отравлений нехарактерна, также нехарактерна патологоанатомическая картина, что затрудняет их установление как у живых лиц, так и в трупном материале при проведении исследования в Бюро СМЭ. По этой причине химико-токсикологический анализ психотропных лекарственных средств представляет собой достаточно трудную задачу.

⦁ химико-токсикологическом анализе психотропных веществ широко используются различные физико-химические методы (ГХ, ВЭЖХ, ТСХ), а также сочетание методов ГХ/МС, ВЭЖХ/МС, что позволяет надежно идентифицировать токсиканты и установить их количественное содержание.

5

  1. НЕЙРОЛЕПТИКИ

1.1. Общая характеристика нейролептиков

Нейролептики, применяемые в медицинской практике. относятся к различным производным. Широко используются производные фенотиазина. Нейролептики группы фенотиазина подразделяются на 3 класса в зависимости от вида заместителя в положении 10: аминопропильного, пиперидинового или пиперазинового, но для всех них характерно наличие в молекуле фрагмента -C-C-C-N структуры, определяющей нейролептическое действие. Основными представителями этой группы являются аминазин, пропазин, левомепромазин, алимемазин, метеразин, этаперазин, френолон, трифтазин, фторфеназин, тиопроперазин, перициазин, тиоридазин. Соединения, имеющие в молекуле только 2 атома углерода в заместителе, не являются нейролептиками, но

обладают антигистаминным (прометазин) или антимускариновым (этопропазин) эффектами.

Общая формула производных фенотиазина

5
S

6
9

7 10

N
8

R1

4

3

2

1 R2

Физико-химические свойства. Основной характер производных фенотиазина обусловлен наличием в структуре молекулы гетероциклического атома азота (рКа 4) и третичного атома азота в алифатическом радикале (рКа 9,1-9,8).

При взаимодействии с кислотами фенотиазины образуют соли, легкорастворимые в воде, спирте, хлороформе, но практически нерастворимые в эфире и бензоле.

Основания фенатиазинов − липофильные вещества, нерастворимые в воде, но растворимые в спирте, эфире, хлороформе, этилацетате. Абсорбция
6

производных фенотиазина в УФ-области спектра характеризуется наличием 2 максимумов при: λ= 250 – 260 нм (Еуд =35000 ) и λ= 300 − 315 нм (Еуд =4500).

Сравнение УФ-спектров солей производных фенотиазина со спектрами их оснований показывает, что они практически идентичны. Следовательно, их УФ-спектры отражают только электронную структуру фенотиазина.

Структурная формула нейролептиков группы включает фенотиазиновую часть молекулы фенотиазина (хлорпромазин, прометазин).

    S       

S
N
N Cl CH3
CH3 H2C CH2 CH2 N
H2C CH2 CH2N CH3
CH3

Хлорпромазин (аминазин) Промазин (пропазин)

S S

N CF3 N SCH3
H2C CH2CH2 N H2C CH2

        N   H3C N   

            CH3     

Трифлуоперазин (трифтазин) Тиоридазин (сонапакс)

Исключение представляют те производные, которые в положении 2

содержат радикалы со свободными n-электронами (тиоридазин, левомепромазин).

Сульфоксиды фенотиазинов (метаболиты) имеют в отличие от нативных (основных) соединений, 4 максимума в УФ-области: при λ 230, 265, 285 и 400 нм.

Производные пиперазина (трифтазин, фторфеназин) являются наиболее активными психотропными препаратами данной группы. Они обладают

7

небольшой антихолинергической активностью, однако при их применении высока вероятность проявления симптомов лекарственного паркинсонизма.

Препараты тиоксантенового ряда, которые, как и препараты фенотиазинового ряда, имеют заместители в положениях 2 и 10, сходны с ними по фармакологическим эффектам, но они менее выражены. Тиоксантены имеют

⦁ своей структуре двойную связь и могут существовать в форме цис- и трансизомеров. Цис-изомеры примерно в 20 раз более активны трансформ или рацематов, а некоторые препараты этой группы эффективны только в том случае, если преимущественно находятся в виде цис-изомера (например,

эуклопентиксол).

Бутирофеноны и дифенилбутилпиперидины (галоперидол, трифлуперидол, меторин, дроперидол, флуспирилен, пимозид, пенфлюридол) сходны по химическому строению. Некоторые бутирофеноны рассматриваются как замещенные пиперидины, а азоперон и флуанизон − как производные пиперазина. Галоперидол обладает наименее выраженной седативной и антимускариновой активностью, однако экстрапирамидные симптомы при его применении проявляются чаще.
Cl

F

O

С    CH2

CH2

CH2

N

OH

Галоперидол

Сульпирид и клозапин выделили в отдельную группу атипичных нейролептиков, так как при их применении симптомы лекарственного паркинсонизма проявляются крайне редко.

8

N N CH3

Cl N

N
H

Клозапин (азалептин)

1.2. Фармакология и токсикология нейролептиков

Антипсихотический эффект нейролептиков обусловлен блокированием центральных дофаминовых рецепторов. Некоторые нейролептики блокируют также адренергические и серотониновые рецепторы. По современным представлениям, развитие психозов связано с нарушением обмена некоторых медиаторов нервной системы и в первую очередь дофамина, норадреналина, серотонина. Большинство существующих антипсихотических лекарств либо блокируют рецепторы этих медиаторов, либо тормозят их высвобождение и обратный захват. Нейролептики оказывают различное действие на центральную и вегетативную нервную систему (блокируют рецепторы многих медиаторов). Антипсихотический эффект, обусловленный в основном торможением дофами-новой передачи, дополняется успокаивающим действием, связанным с блокадой рецепторов норадреналина и серотонина. На этом фоне усиливается и увеличивается продолжительность действия принимаемых совместно с нейролептиками лекарств, угнетающих ЦНС, ‒ препаратов для наркоза, снотворных и др. Торможение дофаминовой передачи является причиной основного побочного эффекта нейролептиков ‒ паркинсонического синдрома, проявляющегося снижением общей двигательной активности, замедленностью движений, дрожанием, повышением мышечного тонуса. Паркинсонизм и болезнь Паркинсона возникают при снижении посреднической роли дофамина

⦁ головном мозге. Многие нежелательные свойства нейролептиков связаны с угнетающим влиянием на рецепторы вегетативной нервной системы. Это и

9

расширение сосудов, и снижение артериального давления, и подавление секреции желез, и понижение температуры тела.

Нейролептики второго поколения (атипичные нейролептики), например клозапин (лепонекс) при клинически полном нейролептическом спектре активности оказывают по сравнению с классическими нейролептиками избирательное нейрохимическое действие. Они селективно блокируют только дофаминовые D2- и D3- рецепторы определенных областей мозга (в частности, мезолимбической) и имеют некоторое сродство к серотониновым рецепторам, чем объясняются особенности их клинического действия, в частности малая выраженность побочных экстрапирамидных эффектов.

Новейшие нейролептики (рисперидон, оланзапин) обладают практически равным сродством к дофаминовым и серотониновым рецепторам. По эффективности они сравнимы или даже превосходят классические нейролептики при значительно более высокой переносимости. Ведущий принцип применения нейролептических средств основывается на зависимости между особенностями психотропного действия (избирательное или общее) и основными характеристиками психопатологического синдрома.

Одна из основных фармакологических особенностей нейролептиков − своеобразное успокаивающее действие, сопровождающееся уменьшением реакции на внешние стимуляторы, ослаблением психомоторного возбуждения и аффективной напряженности, подавлением чувства страха, ослаблением агрессивности. Они в основном используются для лечения различного рода психических заболеваний, главным образом, шизофрении или паранойи, а также: мании, делирия, ажитированной депрессии, тревожных состояний. Кроме того, они эффективны при сильных беспокойствах, а некоторые из них обладают антидепрессивным действием. В качестве противорвотных средств их используют для контроля тошноты и рвоты, возникающих, например, при химиотерапии рака, и могут назначаться в комбинации с наркотическими аналгетиками, действие которых они потенцируют. Помимо действия на дофаминовые рецепторы, они вызывают антимускариновые, антигистаминные

10

⦁ антисеротониновые эффекты. Некоторые психотропные препараты этой группы блокируют α-рецепторы, что способствует развитию ортостатической гипотензии. Применение клозапина часто сопровождается развитием у больных агранулоцитоза, поэтому при его использовании необходим постоянный контроль показателей крови и при первых проявлениях лейкопении следует прекратить прием препарата. Почти все препараты, применяемые как нейролептические средства, относятся к списку сильнодействующих веществ.

При их терапевтическом применении у некоторых больных отмечаются побочные нежелательные эффекты, а в случае передозировки или умышленного принятия их в повышенном количестве возможны серьезные отравления и летальный исход.

Отравления наблюдаются при приеме 5‒10 г (субстанции) и характеризуются резкой слабостью, потерей сознания, комой. Зрачки сужены, артериальное давление снижено, понижается температура тела, появляются кожные аллергические реакции.

Первая помощь. При пероральном приеме препарата производят промывание желудка, используют активированный уголь, дают солевые слабительные для форсирования диуреза, крепкий чай (кофеин). На госпитальном этапе проводится детоксикационная гемосорбция.

1.3. Токсикокинетика и биотрансформация

Большинство нейролептиков характеризуется хорошим всасыванием в кровь из мест поступления при разных путях введения (перорально, внутримышечно). Они проникают через гематоэнцефалический барьер, однако накапливаются в мозге в значительно меньшем количестве, чем во внутренних органах (печень, легкие). При пероральном приеме биодоступность хлорпромазина составляет приблизительно 30 %.

Нейролептики подвергаются биотрансформации в печени и выделяются в значительных количествах с мочой и частично с калом. При поступлении в кровь нейролептики связываются с белками плазмы крови преимущественно с
11

альбуминами. Кажущийся объем распределения Vd для большинства нейролептиков составляет более 20 л/кг, однако имеются и некоторые исключения. Так, Vd для сульпирида составляет всего 2 л/кг. Т1/2 большинства нейролептиков равен 10‒30 ч. Лекарственные препараты с наиболее сильно выраженными липофильными свойствами, такие как пимозид и пенфлюридол, имеют Т1/2 100‒200 ч, в то время как сравнительно более гидрофильный сульпирид практически полностью выводится с мочой в неизмененном виде с Т1/2 около 10 ч. Т1/2 фторфеназина после инъекции в виде энантата составляет 3,5 дня, а при введении в виде деканоата его Т1/2 достигает 7‒10 дней. Для сравнения, при пероральном или внутримышечном введении этих препаратов в неэтерифицированном виде Т1/2 составляет 15‒20 ч.

Всасываются фенотиазины как вещества основного характера преимущественно из кишечника. Гидрофобный характер оснований фенотиазинов способствует взаимодействию их с белками. Vd приближается к 100 %, поэтому фенотиазины локализуются в тканях органов (мозг, печень, почки). Выводятся почками, в моче обнаруживаются в основном в виде метаболитов.

Биотрансформация фенотиазинов протекает 3 путями:

⦁ 1-й путь − трансформация в радикалах R1 и R 2 : N-O-S-деметилирование, которое приводит к увеличению полярности соединений; окисление R1-боковой цепи;

⦁ 2-й путь ‒ окисление гетероциклического атома серы в сульфоксид или сульфон. Сульфоокисление − образование сульфоксидов со степенью окисления серы +4 и +6.

⦁ 3-й путь − ароматическое гидроксилирование в положении 3 и 6 с последующим конъюгированием с глюкуроновой кислотой.

⦁ результате изучения биотрансформации хлорпромазина было установлено, что при объединении всех известных путей метаболизма образуется более 150 возможных метаболитов препарата. В плазме крови

образуется хлорпромазина сульфоксид. В результате деметилирования

12

образуются моно- (нор1)- и дидесметил (нор)- метаболиты хлорпромазина, при

окислении – хлор-промазин-N-оксид. Происходит ароматическое гидроксилирование в положении 7 и в меньшей степени в положении 3. Большая часть фенольных метаболитов присутствует в форме конъюгатов, которые можно гидролизовать с помощью D-глюкурониларил-сульфатазы. Присутствие небольшого количества 3-гидроксипромазина свидетельствует о процессе дегалогенирования. Дезаминирование дает 2-хлорфенотиазин-10-пропионовую кислоту, а при полной потере боковой цепи − 2-хлорфенотиазин.

Метаболизм хлопромазина
реакция окисления гетероатома серы

                    O               
S                   S               

N               Cl  N           Cl  
                                CH3 
                    CH              
                    3               

H CCH 2 CH 2 N H2C CH2 CH2 N
2 CH3
CH3
O O
S
N CH3

                    H2C CH2 CH2 N   
                                CH3 

Метаболизм промазина
реакция гидроксилирования (окисления)

S                   HO  S       
N                       N   CH3 
                    CH3         

H C CH 2 CH 2 N H2C CH2CH2N
2

CH3 CH3

13

Метаболизм промазина
реакция N-окисления

S S

N N
CH3
CH3
H2C CHCH2 N
CH CH2 N
H2C
CH3 O CH3

Метаболизм хлорпромазина
реакция N-деметилирования

S S

N Cl N Cl

        CH3         CH3 

H2C CH2 CH2 N
H2C CH2 CH2 NH
CH3
S
N Cl
H2C CH2 CH2 NH2

Метаболизм промазина
вторая стадия (реакция конъюгации)

HO S

        O   S       
        COOH            

N O
CH3
HO N
H2C CH2CH2 N CH3

    CH3    HO   H2CCH2  CH2    N        
        OH      CH3 

14

Другие фенотиазины имеют сходные пути биотрансформации, однако препараты с более сложными заместителями образуют и большее количество метаболитов. Например, 2-тиометильная группа в тиоридазине окисляется в сульфоксид (мезоридазин) и сульфон (сульфоридазин), которые также обладают нейролептической активностью.

Метаболизм тиоридазина
реакция S-деметилирования

S           S       

N       SCH3    N   SH  

H C CH 2 H2C CH2
2
H C N H3C N
3

Галоперидол в организме подвергается биотрансформации примерно на 40%. Галоперидол всасывается в основном в тонком кишечнике, в неионизированной форме, путем пассивной диффузии. Максимальная концентрация в плазме крови достигается через 2‒6 ч. Биодоступность препарата составляет 60‒70 %. Около 90 % галоперидола связывается с белками плазмы крови, 10 % представляют собой свободную фракцию. Отношение концентрации в эритроцитах к концентрации в плазме крови составляет 1:12. Концентрация галоперидола в тканях выше, чем в крови; отмечена тенденция препарата к кумуляции в тканях. Метаболизируется в

печени. Окислительное дезалкилирование дает 1-(4-фторобензоил)-пропионовую кислоту и ее конъюгат с глицином, а также 4-фторофенилуксусную кислоту, ее конъюгат с глицином и 4-фторофенилацетуровую кислоту, которые являются фармакологически неактивными соединениями. Вероятно, галоперидол может быть конъюгирован

⦁ глюкуроновой кислотой и/или сульфат-ионами без предварительных метаболических изменений. При восстановлении галоперидола образуется

15

вторичный спирт, часто называемый восстановленным галоперидолом. Это соединение обладает фармакологической активностью (около 25 % активности исходного вещества) и может окисляться снова в галоперидол. Галоперидол экскретируется с мочой (40 %) и калом (60 %). Т1/2 после перорального применения составляет 12‒37 ч. Проникает через гематоэнцефалический барьер

⦁ плаценту. Другие бутирофеноны имеют сходные пути метаболизма, например бромперидол.

            Cl      
Метаболизм галоперидола         
O                   

F С CH2 CH2 CH2N
OH
O O

F C CH2 CH2 F C CH2

    C   O       O   

HO HO

Биотрансформация психотропных препаратов с боковой пиперазиновой цепью имеет еще более сложный характер. В пиперазиновой цепи происходит раскрытие кольца с получением этиленлдиаминовых производных и полной потерей кольцевых атомов углерода. При этом получаются первичные аминосоединения, идентичные с теми, которые образуются при повторном деметилировании (дидеметилировании) диметиламино замещенных исходных веществ.

При окислении сульпирида в положении 2 пирролидинового кольца образуется пирролидинон.

Пимозид может вступать в некоторые реакции окислительного N-дезалкилирования с образованием бензимидазолин-2-она, 1-(4-пиперидил)-бензимидазолин-2-она, 4-бис(4-фторфенил)-бутировой кислоты, окисление которой в положении 8 дает 2-бис(4-фторфенил)-уксусную кислоту.

16

Метаболитами клозапина являются фармакологически активный N-

дезметилклозапин и N-оксид клозапина.

Метаболизм клозапина

N-деметилирование

N   N   CH3 N   NH  

Cl N N

N           N       
            H       
H                   

    Метаболизм клозапина            
    реакция N-окисления         
N   N   CH3 N   NCH 
                3   

Cl N N

N NH

H O

⦁ результате биотрансформации могут образовываться стереоизомерные соединения, например восстановление карбонильной группы пропиомазина и галоперидола приводит к образованию асимметрического атома углерода.

Конфигурация восстановленного галоперидола может оказывать влияние на его фармакологическую активность. Энантиомеры обычно присутствуют в приблизительно равных количествах, выделение и количественное определение одного из них могут привести к недооценке реального количества токсичного вещества.

1.4. Пробоподготовка биологического материала

Для выделения нейролептиков из биологических материалов используют ЖЖЭ, ТФЭ и ферментативный гидролиз.

17

Жидко-жидкостная экстракция. Многие психотропные препараты легко экстрагируются из плазмы в относительно неполярные растворители в щелочной среде. Наиболее часто для этого используются н-гептан, н-гексан и н-пентан, обычно с добавлением небольшого количества изоамилового или изопропилового спирта для уменьшения адсорбционных потерь. Более полярные соединения экстрагируют более полярными растворителями (хлороформ). При количественном определении метаболитов используют диэтиловый эфир, дихлорметан и этилацетат.

Если пробу исследуют газохроматографически, в частности с электронозахватного детектора (ЭЗД), необходимо добавить кислоту в следовых количествах, а после установления необходимого рН провести последующую реэкстракцию в органический растворитель. В тех случаях, когда параметры разделения позволяют, используют экстрагирование в небольшой объем органической фазы, для того чтобы впоследствии не было необходимости в ее упаривании. Пробы, анализируемые методом ГХ с азотно-фосфорным детектором (АФД) или методом ВЭЖХ, как правило, не подкисляют.

Твердофазная экстракция. ТФЭ нейролептиков дает хорошие результаты при последующем определении методами ВЭЖХ и ГХ/МС. ТФЭ хлорпромазина и его 13 метаболитов проводят на колонке, заполненной

модифицированным силикагелем С8, которую подготавливают последовательным промыванием избыточным объемом 0,2 М фосфорной кислоты, 0,25 % натрия карбоната, метанола и воды. Плазму крови (1 мл) подкисляют 3 М раствором Н3РО4, и наносят на колонку, которая затем последовательно промывают водой, метанолом и Na2CО3. Определяемые вещества (аналиты) элюируют метанолом. Для ТФЭ нейролептиков используют различные типы патронов.

Ферментативный гидролиз. Гидролиз глюкуроновых и сульфатных конъюгатов с помощью Р-глюкуронидазы/арилсульфатазы предпочтительны, чем кислотный гидролиз, потому что фенольные метаболиты легче окисляются
18

⦁ кислой среде. Для определения хлорпромазина и его метаболитов, а также тиоридазина в тканях, взятых после вскрытия трупа, используют протеолитические ферменты это дает хорошие результаты.

1.5. Предварительные методы анализа

Химический метод

Цветные реакции (предварительные испытания). Многие нейролептики при окислении образуют характерные окрашенные соединения в присутствии серной кислоты. Для экспресс-диагностики фенотиазинов в моче используют групповую реакцию с FNP-реактивом (смесь хлорида железа (III), хлорной и азотной кислот)

Цветные реакции могут лежать в основе фотометрического метода определения. Коэффициент светопоглощения и цвет окрашенного соединения в 50 % растворе серной кислоты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Окрашивание нейролептиков в 50 % растворе серной кислоты

Вещество Заместители в Окрашивание λ, нм
положении 2

Промазин Н 514

Акпромазин СОСН3 514

Пропиомазин СОС2Н5 520

Метиоримепразин ОСН3 568

Тиоридазин SCH3 Бирюзовый 640

Сульфоридазин SOCH3 Розово-оранжевый 510

Мезоридазин S02CH3 Розовый 525

Хлорпромазин CI Розовый 532

Фторфеназин CF3 Розово-оранжевый 501

Трифторпромазин CF3 501

7-ОН фторфеназин CF3 Розовый 559

19

Как правило, электроноакцепторные группы изменяют окрашивание раствора от зелено-синего (650‒600 нм) до красного (530 нм) и оранжево-розового (500 нм). Метиловые эфиры, например 7-метоксихлорпромазин, и фенолы образуют соединения, окраска которых идентична. Фенольные метаболиты менее стабильны по сравнению с исходными соединениями.

Тонкослойная хроматография

Обычно ТСХ используется для качественного или промежуточного полуколичественного скрининга, но иногда ее применяют для количественного

определения, например хлорпромазина и его 11 метаболитов, трифторпиперазина и др. с использованием денсиметрического сканирования. Плазму крови (4 мл) с добавленным внутренним стандартом трифлуофеназина экстрагируют гептаном. После реэкстракции устанавливают рН раствора карбонатом натрия и вновь экстрагируют аналит пентаном. Двухмерную хроматографию проводят на пластинах HP для ТСХ размером 10∙10 см. Первое проявление в среде толуол–ацетон (60:40) проводят для очистки от мешающих соединений. Флуфеназин (Rf = 0,2) и внутренний стандарт (Rf = 0,5) разделяют в среде толуол–ацетон–аммиак (60:40:2). После рассмотрения пластинок в УФ-свете, определяют содержание веществ по их флюоресценции. Чувствительность определения флуфеназина составляет 0,1 мкг/л, коэффициент вариации при обнаружении вещества в концентрации 0,5 мкг/л составляет 8 %.

Аналогичный способ применяют для определения хлорпромазина и тиоридазина. Пластины HP подвергают воздействию паров азотной кислоты и проводят количественное определение вещества в пятне, измеряя оптическую плотность при 365 нм (хлорпромазин) и 375 нм (тиоридазин). Чувствительность метода составляет 10 мкг/л.

Радиоиммунный и радиорецепторный анализ

Разработаны методики определения радиоиммунным методом

соединений фенотиазинов и их метаболитов, среди которых галопиридол,

20

хлорпромазин, фторфеназин, перфеназин, трифторперазин, прохлорперазин, тиоридазин. Предел определения при использовании 1 мл плазмы составляет 20 нг/л. Для определения галоперидола в присутствии метаболитов была получена высокоспецифичная антисыворотка, но при ее использовании наблюдали кросс-реакцию с другими бутирофенонами, такими, как бромперидол, моперон, трифлуперидол и спиперидон. В настоящее время из крови морских свинок получена антисыворотка с использованием гаптена, связанного в положении, занимаемом атомом фтора, которая дает кросс-реакцию менее чем с 1 % известных метаболитов. Разработан способ иммунного анализа для сульпирида. Метод радиорецепторного определения нейролептиков дает хорошие результаты. Чувствительность метода (в микрограммах на 1 л) зависить от природы соединения: для фторфеназина – 1,8, трифторперазина – 2,2, галоперидола – 2,5, хлорпромазина – 8,6, тиоридазина – 30.

1.6. Подтверждающие методы анализа

Газовая хроматография

Использование ПИД (пламенно-ионизационный детектор). Нейролептики являются липофильными соединениями. При низких дозах поступления (стандартная терапия) концентрации препаратов в плазме крови невысоки. Поэтому ПИД используют для определения ограниченного числа препаратов в плазме, метаболитов в моче или при значительной передозировке.

ПИД применяют для определения хлорпромазина и некоторых его метаболитов в моче (колонка – 5 % SE-30). Деметилированные метаболиты выделяют в форме ацетамидов. Хлорпромазина нитрат и хлорпромазина нитрат-сульфоксид селективно экстрагируют и исследуют в УФ-свете (сульфоксиды восстанавливают до соответствующих сульфидов перед началом определения). Для определения в моче фенольных и нефенольных метаболитов хлорпромазина используют колонки OV-3 и OV-17. Дериватизацию проводят триметилсилилимидазолом.

21

Использование электронно-захватного детектора (ЭЗД). ЭЭД и усовершенствованные силиконовые стационарные фазы, например OV–17, позволяют проводить мониторинг концентраций нейролептиков в плазме крови даже при их применении в терапевтических целях. Так определяют хлорпромазин и его деметилированные и сульфоксидные метаболиты в плазме крови. Соединения экстрагируют из подщелоченной плазмы в гептан, проводят реэкстракцию в кислой среде и после установления необходимого рН экстрагируют в небольшой объем толуола.

ГЖХ с электронно-захватным детектором используют для количественного определения в крови и плазме. Перед определением проводят дериватизацию соединения уксусным ангидридом. В образце объемом 5 мл предел обнаружения составил 0,2 мкг/л.

Для определения галоперидола, его восстановленного метаболита и трифлуперидола используют ЭЗД с применением капиллярных колонок (DB-15

⦁ ∙ 0,53 мм). Внутренний стандарт – флюразепам. При определении в насадочных колонках соединения дериватизируют – ацетилируют трифторуксусным ангидридом. Чувствительность метода 10 мкг/л.

Использование АФД (азотно-фосфорный детектор). Применение газовой хроматографии с использованием селективного АФД, который отличается от предыдущих детекторов лучшим линейным диапазоном и стабильностью,

расширило круг анализируемых нейролептиков. Фторфеназин, 7-гидрокифторфеназин и фторфеназина сульфоксид детектируют в моче с

использованием АФД. Соединения хроматографируют в форме триметилсилильных эфиров, которые имеют преимущество перед ацетатными эфирами, поскольку ацетилпроизводные фенольных и сульфоксидных соединений не могут быть успешно разделены. Чувствительность детектора – 2 мкг/л.

При определении клозапина в 1 мл плазмы на капиллярной колонке DB-5 чувствительность метода составляет 1–2 мкг/л. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетилированный мапротилин.
22

Масс-спектрометрия в сочетании с ГЖХ и ВЭЖХ

Использование режима селективного мониторинга ионов позволяет детектировать низкие уровни метаболитов и проводить точное определение в присутствии других веществ. ГХ/МС применяют для определения хлорпромазина, норхлорпромазина и 7-гидроксихлорпромазина в плазме и спинномозговой жидкости. В работе использовали 2Н-меченые материалы в качестве внутренних стандартов. Чувствительность метода 1 мкг/л.

Используя капиллярные колонки, определяют галоперидол (0,2 нг) в образце плазмы объемом 2 мл. Для достижения такого уровня чувствительности проводят дериватизацию трифторуксусной кислотой, а затем масс-спектрометрию в режиме химической ионизации с аммиаком в качестве газа-реагента.

Клозапин и его деметилированный метаболит определяют в плазме крови

⦁ использованием капиллярных колонок, заполненных плавленым кварцем, и масс-спектрометрии в режиме селективного мониторинга ионов. Н-пропильный гомолог используют как внутренний стандарт. Чувствительность 1 и 5 мкг/л для основного препарата и метаболита соответственно.

Высокоэффективно-жидкостная хроматография

ВЭЖХ самый распространенный способ определения нейролептиков в настоящее время. Разработано много методик для широкого круга препаратов. Для хроматографирования чаще всего используют модифицированный кварц и щелочные элюенты. Работа на кварцевых колонках обеспечивает хорошую форму пиков и их полное разделение при правильном выборе мобильной фазы. Аналиты связываются с липофильными основаниями (примесями), поэтому относительное удерживание может варьировать при изменении рН. Замена ацетонитрила метанолом улучшает форму пика и разрешение метода. Вначале элюируются липофильные примеси, а затем более полярные метаболиты.

23

Детектирование в методе ВЭЖХ. Фенотиазины имеют максимум поглощения в УФ-области при коэффициенте экстинции около 30 000 М – 1 см-1

⦁ области 245–260 нм, поэтому можно проводить УФ-детектирование. При оптимальном выборе режима хроматографирования нижняя граница определения составляет несколько нанограммов на 1 л. Так, галоперидол имеет

λmах при 245 нм, е = 13000 М-1 см-1, a RHAL – λтах 200 нм с небольшим поглощением при 250 нм, поэтому определяя оба соединения, надо проводить детектирование при более низких длинах волн или при одной более высокой длине волны в случае определения одного галоперидола.

Фенотиазины при окислении образуют флюоресцирующие соединения, и это особенно часто используется в отношении тиоридазина, который окисляется после прохождения через колонку с КМnО4. Избыток перманганата удаляют реакцией с Н2О2, продукты второй реакции измеряют флюориметрически. Собственная флюоресценция некоторых соединений позволяет проводить количественное определение без дериватизации и химической модификации, что характерно для сульпирида и пимозида.

2.ТРАНКВИЛИЗАТОРЫ

2.1. Общая характеристика транквилизаторов

В основном транквилизаторы представлены производными бензодиазепина. Популярность бензодиазепинов объясняется, главным образом, их широким терапевтическим спектром, минимальным побочным действием, особенно, в сравнении с другими снотворными и психотропными препаратами.

По клиническому действию бензодиазепины делятся на следующие группы:

⦁ снотворные и седативные (нитразепам);

⦁ анксиолитики (снимают чувство беспокойства, страха) и малые транквилизаторы (диазепам);

⦁ антидепрессанты (хлордиазэпоксид);

24

⦁ мышечные релаксанты (диазепам);

⦁ противосудорожные (диазепам);

⦁ внутривенные анестетики.

Типы бензодиазепинов

H O H O H O
N N N

                OH          

Br N Cl N O2N N

                        Cl  
Cl                          

H3C NHCH3
O N

N
Cl N
N O

Феназепам Оксазепам Нитрозепам Диазепам Хлордиазепоксид

Большинство оснований производных бензодиазепинов белые кристаллические вещества (исключая нитропроизводные), чаще всего растворимы в большинстве органических растворителей, таких как этиловый эфир, этилацетат, хлороформ, метанол и нерастворимы в воде. Липофильность (lgKp) находится в диапазоне 2,16–2,98. Производные 1,4-бензодиазепина являются слабыми основаниями. Соединения, имеющие в своей структуре амидную группу, проявляют амфотерные свойства.

Многие бензодиазепины в кислой среде гидролизуются с образованием соответствующих бензофенонов.

Реакция гидролиза бензодиазепинов

R1
N NH2
R 3 H2O

N H + R O

R2

R
R4

25

2.2. Фармакологическое действие

Все производные бензодиазепина по клиническому действию обладают

анксиолитическим, седативным, снотворным, транквилизирующим,

противосудорожным, релаксирующим действием в широком фармакодинамическом спектре. Однако преобладание того или другого действия значительно варьирует в зависимости от структуры этих веществ.

Наличие семичленного имино-лактамового кольца важно для действия этой группы веществ на центральную нервную систему, замещение благоприятно лишь в 1, 3, 7 и 2′. Как правило, электроотрицательные заместители в положении 7 и 2′ значительно увеличивают активность, доноры электронов снижают активность.

Заместители в положении 7 располагаются в ряду активности следующим образом: NO2 >CF3> Br >CN >C1 >N(СНз)2 > SOCH3 > SC4H9 > SCH3 >СН3 >Н> SO2CH3 >Ph >F.

Заместители в положении 2′ располагаются в ряду активности следующим образом: CI >F >Br >NО2 >CF3 >H >ОСН3 >СН3.

Электроотрицательный фтор является слабым активатором в 7 положении, в противоположность его действию в положении 2′. Заместители в любом другом положении в кольце А и С уменьшают активность. Галоген в 4′ положении приводит почти к полной дезактивации.

⦁ кольце В наиболее выраженный положительный эффект достигается замещением метильной группой в положении 1, большие заместители снижают активность. Замещение алкильными и арильными группами в положении 3

оказывает отрицательное влияние на активность. 3-гидрокси производные, а также 3-карбокси производные и их эфиры активны. 3-карбокси производные очень легко декарбоксилируются и их активность такая же, как активность незамещенных веществ.

Бензодиазепины связываются со специфическими бензодиазепиновыми рецепторами, расположенными, главным образом, в лимбической системе, с

26

помощью медиатора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и циклического нуклеотида.

2.3. Фармакокинетика и метаболизм

Большинство бензодиазепинов быстро и полностью всасываются в желудочно-кишечном тракте. Максимальная концентрация в плазме достигается через 1–3 часа после приема внутрь.

Скорость проникновения бензодиазепинов в ткани и выведения из них зависит от скорости кровотока, градиентов концентрации и проницаемости. Растворимость в липидах играет главную роль, определяющую скорость, с которой бензодиазепины попадают в центральную нервную систему. Большинство бензодиазепинов интенсивно связываются с белками плазмы крови (в среднем от 80 до 97 %).

Для окончательного выведения почти всех бензодиазепинов из организма требуется их превращение в более водорастворимые метаболиты. В этом наиболее важную роль играют микросомные метаболизирующие ферментные системы печени. В связи с тем, что очень мало бензодиазепинов выделяются в неизменном виде, их период полужизни зависит от их пути метаболизма.

Бензодиазепины метаболизируются путем гидроксилирования

(алифатического и ароматического), дезалкилирования, реакций восстановления и ацетилирования (фаза I), с последующим конъюгированием перед выделением с глюкуроновой кислотой (фаза II). В большинстве случаев метаболиты в фазе I обладают некоторой биологической активностью, которая может быть больше или меньше по сравнению с нативными веществами, в то время как конъюгаты не обладают значительной активностью. Некоторые бензодиазепины могут рассматриваться, как пролекарства.

Примеры метаболизма бензодиазепинов

CH3 H

N N

    деметилирование     

Cl N Cl N

     27      










CH3     
N       
    гидроксилирование   

Cl N Cl

H3C

N

OH

N

CH3     CH3     

N       N       

    гидроксилирование       OH  

Cl N Cl N коньюгация
Cl

CH3

N

O

N O

OH COOH

HO HO

Оксазепам       Нордазепам      
H   O       H   O   
N           N       
        OH          

Cl N Cl N

Оксазепам и нордазепам являются наиболее часто встречающимися метаболитами этой группы веществ. Период полувыведения нордазепама длинный (40–100 часов). Поэтому вещества, метаболизирующиеся до нордазепама, считаются долго действующими. Производные бензодиазепина последнего поколения (празепам и галазепам) так быстро метаболизируются до нордазепама и соответствующих гидрокси метаболитов, что нативные вещества

28

не определяются в крови и моче. Клоразепам превращается в нордазепам уже в желудке.

Метаболизм нитразепама включает восстановление нитрогруппы до аминогруппы и её последующее ацетилирование с образованием 7-ацетамидонитразепама. Дополнительно у нитразепама может расщепляться семичленное кольцо с образованием соответствующего аминобензофенона.

Метаболизм нитразепама

H   O       H   O       H   O   
                        N       
N           N                   

O2N N H2N N HN N

                    CCH3            
                    O           

Бензодиазепины делятся на три группы в зависимости от продолжительности действия: короткого действия (период полувыведения менее 10 часов), средней продолжительности действия (10–24 часа) и длительного действия (более 24 часов). Продолжительность действия некоторых бензодиазепинов зависит не только от периода полувыведения самого препарата, но также от возможного образования активных метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных бензодиазепина снижает скорость элиминации. Выводятся производные бензодиазепина в основном почками в виде основных соединений и метаболитов. Фармакокинетика основных бензодиазепинов приведена в таблице 2. Часть производных бензодиазепина может перераспределяться в тканях после смерти, при этом соотношение концентраций в крови из сердца/бедра составляет 1,5–4 раза в зависимости от природы соединения. Большинство

29

бензодиазепинов интенсивно связываются с белками плазмы (в среднем от 80 до 97 %).

Таблица 2
Фармакокинетика бензодиазепинов

Наименование Пик Связывание с Vd (л/кг) Т1/2 (час) рКа рКа
действия
(час) белками, %

хлордиазепокид 0,5–3 96,5 0,3 5–30 4,6
диазепам 0,5–1,5 98,7 1,1 20–70 3,3
нитрозепам 0,5–4 86–88 1,6–22 23–29 3,2 10,8
оксазепам 1–4 95,5–100 0,7–1,3 5,4–9,8 1,7 11,6
феназепам 6 97 9,3–19,5 0,6–2,0 2,7 10,0

2.4. Токсикология

Бензодиазепины часто вызывают привыкание и пристрастие. Ощутимое желание облегчить беспокойство, подавленность, вызвать эйфорию и сон приводит к привыканию, пристрастию и зависимости от бензодиазепинов. Наблюдается как психологическая, так и физическая зависимость. Психологическая зависимость проявляется в нервозном поведении, которое трудно отличить от состояния курильщиков сигарет. Когда последствия становятся серьезнее, появляется толерантность и физическая зависимость. Повторное применение бензодиазепинов приводит к развитию толерантности, т. е. к увеличению необходимых доз, в несколько раз больших терапевтических. Вследствие этого концентрация в крови будет значительно превышать терапевтическую концентрацию, указанную в литературе. Физическая зависимость от бензодиазепинов может привести к синдрому абстиненции, включая гиперактивность, беспокойство, делирий, галлюцинации

⦁ мышечные судороги. Более длительно действующие бензодиазепины при применении часто вызывают более выраженный синдром абстиненции,

продолжающийся в течение нескольких дней после прекращения приема препарата.

30

При максимальной концентрации в плазме бензодиазепины могут вызывать различную степень апатии, увеличение времени реакции, нарушение моторной координации, атаксию, нарушение умственной и психомоторной функции беспорядок мыслей, спутанность сознания, сухость и горечь во рту. К другим побочным эффектам бензодиазепинов относятся слабость, головная боль, затуманенное зрение, головокружение, тошнота и рвота, эпигастральное расстройство и диарея, суставные боли, боли в области грудной клетки, у некоторых может развиться недержание.

Передозировка бензодиазепинов вызывает сонливость, атаксию (расстройство координации движения), мышечную слабость и глубокую кому. После приема внутрь и внутривенного введения больших доз бензодиазепинов часто наблюдается амнезия.

Применение бензодиазепинов с другими веществами, такими как алкоголь и наркотики, усиливает токсический эффект. Одновременное применение бензодиазепинов и алкоголя так же, как прием повышенных доз бензодиазепинов, вызывает значительные изменения в поведении человека, вызывая агрессию, расстройство психических процессов и растормаживание, как это наблюдается у хронических алкоголиков.

Для лечения передозировки бензодиазепинов вводят специфический антагонист бензодиазепинов – флюмазенил. Внутривенная доза флюмазенила до 1 мг снимает кому и депрессию ЦНС. Флюмазенил принимают также и внутрь.

Бензодиазепины часто являются причиной отравлений и встречаются в судебно-медицинской практике.

Взаимодействие бензодиазепинов с другими центрально действующими веществами, такими как алкоголь, опиаты, трициклические антидепрессанты, фенотиазины или барбитураты могут привести в смертельной интоксикации при более низких концентрациях. Бензодиазепины могут оказывать влияние на познавательную и психомоторную деятельность и таким образом ухудшать

31

внимание водителей. Это неблагоприятное влияние может усиливаться алкоголем.

2.5. Пробоподготовка и методы анализа производных бензодиазепинов

Как было указано выше, бензодиазепины метаболизируются путем гидроксилирования, дезалкилирования и реакций восстановления с последующим образованием глюкуронидов. При выборе метода анализа на тот или иной бензодиазепин необходимо руководствоваться информацией о путях

метаболизма применительно к выбранному для анализа объекту (биологической пробе). Метод анализа зависит не только от типа пробы

и цели исследования (обнаружение нативных веществ и метаболитов или продуктов гидролиза), но и от поставленных задач, а именно качественное обнаружение или количественное определение, предварительный или

подтверждающий метод анализа, инструментальных возможностей лаборатории (ТСХ, ГХ, ГХ/МС, ВЭЖХ) и количества анализируемого вещества, которое может быть получено в конечной стадии анализа. Это и определяет размер пробы, требующейся для анализа. Химические свойства бензодиазепина определяют правильный подход к анализу. Структура бензодиазепина определяет метод извлечения, какому детектору в хроматографе надо отдать предпочтение для повышения чувствительности, снижения влияния соэкстрактивных веществ и повышения специфичности.

Скрининговые методы, даже если они высоко селективны и чувствительны, должны быть подтверждены независимыми химическими и инструментальными методами для обеспечения надежности результата. И главное, любой метод, который строится на основании изложенных ниже рекомендаций, должен быть отработан и проверен в лаборатории на стандартных веществах и тех же самых биологических матрицах, что и исследуемые пробы, для решения пригодности метода для поставленных задач.

Необходимо провести определение пределов обнаружения, т.е.

наименьшего количества вещества, при котором лаборатория, используя

32

данный метод, может надежно обнаружить вещество, а также уровня, при котором результат исследования пробы может считаться положительным или отрицательным.

Кроме того, в лаборатории должен быть определен предел определения, т.е. наименьшая концентрация, при которой исследуемое вещество определяется при заданной степени вероятности.

Существуют два основных подхода для экспериментального определения предела обнаружения и предела определения; статистический и эмпирический.

Для статистического решения готовятся позитивные пробы на той же биологической матрице, что и исследуемая проба, и анализируются множество раз тем же методом (например, п=10). Определяется средний результат и стандартное отклонение (SD) от среднего. Согласно этому подходу принято, что статистический предел обнаружения равен среднему плюс трехкратное SD (99% вероятность), а статистический предел определения равен среднему результату плюс 10 кратное стандартное отклонение. Кроме того, предел обнаружения должен иметь отношение сигнал/шум 3:1, а предел определения сигнал/шум 10:1.

Более широко принят эмпирический подход, который включает использование серийных разведений позитивных проб соответствующим разбавителем (например, исследуемой биологической матрицей). Разведения готовятся и исследуются до концентрации, при которой результат впервые не отвечает критериям метода.

Другим непременным требованием в токсикологическом анализе является использование отрицательных и положительных контролей. При этом контрольный материал должен готовиться на той же матрице, что и проба, которая будет исследоваться. При использовании единичных измерений, по крайней мере, одна положительная контрольная проба должна быть проанализирована в аналогичных условиях, и концентрация исследуемого вещества в ней должна находиться вблизи уровня, при котором результат исследования пробы считается положительным, (по некоторым требованиям,
33

на 25 % выше и ниже концентрации, при которой проба считается положительной). При этом калибровка и контрольная проба должна анализироваться одновременно тем же методом. Исследованная за несколько дней до или после анализа неизвестного, во внимание не принимается.

Отрицательная проба исследуется по двум причинам:

  1. Для исключения влияния эндогенных веществ при использовании даже высоко специфичного аналитического метода, особенно при низком содержании вещества;
  2. Для исключения попадания исследуемого вещества из предыдущей пробы, которая анализировалась на данном приборе.

Часто требуется обнаружить в крови или в тканях внутренних органов нативные бензодиазепины или дезалкилированные метаболиты. Эти вещества экстрагируются, как будет описано ниже, различными растворителями.

Большинство бензодиазепинов в дальнейшем метаболизируются до гидрокси ‒ бензодиазепинов, например, до оксазепама. Эти гидрокси метаболиты выделяются с мочой почти полностью в виде глюкуронидов, растворимых в воде. Глюкурониды должны гидролизоваться до получения свободной формы метаболитов для эффективной экстракции органическими растворителями и для возможности связывания с антителом в иммуноферментном анализе. Рекомендуется для этих целей энзиматический гидролиз, т.к. в сильно кислой или щелочной среде может произойти расщепление структуры самих бензодиазепинов.

Следует иметь в виду, что ферментативная активность β-глюкуронидазы не одинакова в разных партиях реагентов. Для исключения возможных осложнений требуется проводить контрольные исследования полученных реактивов.

При выборе экстрагента для извлечения токсикантов принимается во внимание помимо эффективности экстракции, его токсичность для персонала лаборатории, удельный вес (легче или тяжелее воды), температура испарения, воспламеняемость, стоимость и некоторые другие качества. Наиболее
34

употребительными являются н-бутилхлорид, дихлорметан, гексан – дихлорметан (70:30. об/об) н-бутилхлорид – этилацетат (1:4 об/об), этиловый эфир и этилацетат.

Из-за различных химических свойств бензодиазепинов, как класса, выход бензодиазепинов не оптимален в одинаковых условиях экстракции.

Пример жидкость-жидкостной экстракции.

  1. 1 мл пробы поместить в стеклянную пробирку емкостью 15 мл. Добавить соответствующий внутренний стандарт.
  2. 1 мл 2М Трис- буфера, рН 9, и 8 мл и – бутилхлорида.
  3. Смесь осторожно вращать в течение 15 мин, затем центрифугировать.
  4. Верхний слой н-бутилхлорида перенести в чистую пробирку и выпарить досуха.
  5. Остаток растворить в растворителе, например, в метаноле для дальнейшего исследования.

Пример твердофазной экстракция мочи с помощью колонок со смешанными фазами.

Материалы и реагенты: колонки Clean Screan DAU (United Chemical Technologies), 0,1M фосфатный буфер рН 6,0.

  1. Гидролизовать 5 мл мочи β-глюкуронидазой.
  2. Добавить соответствующий внутренний стандарт.
  3. Кондиционировать колонку последовательно 3 мл метанола, 3 мл воды и 1

мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,0.

  1. Пропустить пробу мочи через влажный сорбент колонки со скоростью 1–2

мл/мин.

⦁ Промыть колонку 2 мл воды, затем 2 мл 20 % раствора ацетонитрила в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,0.

⦁ Просушить колонку, создавая вакуум-насосом около 5 мин.

⦁ Промыть колонку 2 мл гексана.

⦁ Элюировать вещества 3 мл этилацетата.

⦁ Выпарить элюат досуха и остаток растворить в 100 мкл этилацетата.

35

Примечание: Выход бензодиазепинов в пределах 85–94 %.

2.6. Предварительные методы анализа

Иммунохимические методы

Различные ИХМ (радиоиммуноанализ, ПФИА, ИФА, иммунохроматографические) используются при скрининге биообразцов. Положительные результаты позволяют сделать предположение о наличии в тестируемом объект вещества из группы бензодиазепинов, но без внутригрупповой дифференцировки. Данные, полученные ИХМ, обязательно подтверждают другими чувствительными и специфичными методами, интерпретируют, сопоставляя с клиническими и лабораторными данными. Наличие в моче аналита и/или его метаболитов свидетельствует только о предшествующем приеме вещества, при этом его концентрация (и/или метаболитов) не коррелирует с концентрацией периферической крови или тяжестью состояния.

Основной недостаток ИХМ высокая перекрестная реактивность веществ со сходной химической структурой (до 80 %), но тем не менее в случаях злоупотреблений или острого отравления препаратами этой группы ИХМ является достаточно надежным и быстрым методом, используемым в химико-токсикологических лабораториях при установлении принадлежности аналита не только к группе бензодиазепинов, но и к различным подгруппам (например, триазоло- и имидазолопроизводные).

Хроматография в тонком слое сорбента

Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) широко используется для скрининга бензодиазепинов и их метаболитов.

ТСХ-скрининг позволяет проводить предварительную идентификацию большого числа веществ в достаточно короткие сроки и сравнительные исследования различных образцов. Бензодиазепины образуют группу разнообразных химических веществ, однако использование в сочетании 3

36

указанных ниже систем ТСХ обеспечивает хорошее разделение. Сорбент ‒ активированный силикагель G на высушенных стеклянных пластинах, покрытие (толщина 0,25 мм) содержит флюоресцентную добавку, которая флюоресцирует при длине волны 254 нм. Используют следующие системы:

⦁ система А: хлороформ‒ацетон (40:20);

⦁ система В: хлороформ‒метанол (90: 10),

⦁ система С: циклогексан–толуол–диэтиламин (75:15:10).

Детекция пятен при последовательном выполнении: УФ-излучение при

254 нм; 2М серной кислоты, нагревание до 80 оС, УФ-излучение при 366 нм;

реагент подкисленный йодплатинат калия (пятна пурпурной окраски). Значения Rf производных бензодиазепина в проявляющих системах А, В, С приведены в таблице 3.

Таблица 3

Хроматографическая подвижность (Rf ∙100) производных бензодиазепина (руководство для национальных лабораторий экспертизы наркотиков, ООН, 2000 г.)

Вещество        Проявляющая система     
    А       В       С   

Диазепам 70 87 30

Нитразепам 42 64 1

Оксазепам 29 48 1

Лоразепам 31 48 1

Лорметазепам 63 81 9

Возможно также обнаружения пятен на хроматограммах, включающим гидролиз бензодиазепинов до соответствующих производных первичных аминобензофенонов, с последующим диазотированием и азосочетанием по реакции Браттона-Маршала. Образованные при этом азокрасители имеют четко выраженное фиолетовое окрашивание.

Схема реакция Браттона-Маршала представляет собой следующее уравнение реакций:

37

NH2             

Cl O NaNO2 + HCl Cl

N+ N

O

N+ N

HN

O
Cl

CH2 CH2 NH2

N N

O NH2

+

Cl

NH


CH2

CH2

Метод рекомендован для мочи, т.к. сильный кислый гидролиз не подходит для крови и сыворотки. В некоторых работах эта процедура включает этап фотолитического дезалкилирования после кислого гидролиза. Однако, как правило, достаточно дезалкилметаболитов, чтобы опустить этот этап дезалкилирования, методика является чувствительной.

Метод не годится для метаболитов бензодиазепина, которые не могут гидролизоваться до первичных аминобензофенонов для реакции Браттона– Маршалла. Это относится к триазоло-бензодиазепинам, как алпразолам. Эстазолам, триазолам, а также к нитро-бензодиазепинам, как нитразепам, клоназепам.

Для 7-аминометаболитов нитро-бензодиазепинов. Как первичные амины, они могут прямо давать реакцию Браттона-Маршалла. Поэтому гидролиз не требуется.

УФ-спектрофотометрия

Структура веществ этой группы определяет характер поглощения в УФ-области. В УФ-спектрах имеются 3 полосы поглощения с Хmaх в областях 200– 215, 220-240 и 290–330 нм. Спектры поглощения производных 1,4-бензодиазепинов и их метаболитов приведены в таблице 4.
38

Абсорбция светового потока производных 1,4-бензодиазепинов в УФ-области изменяется в зависимости от рН их растворов:

⦁ в кислой среде – за счет протонирования атома азота в положении 1 или 4;

⦁ в щелочной среде возможно изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за счет лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положении 1,2).

Способность к избирательному поглощению в УФ-области спектра положено в основу идентификации соединений данной группы по электронным спектрам поглощения. Для применения данного метода анализа необходима предварительная очистка извлечения из биологического материала (чаще всего с использованием ТСХ). Обнаруженное на хроматограмме пятно (по флюоресценции в УФ-свете) элюируется подходящим растворителем и затем снимается спектр поглощения.

Примеры спектральных характеристик некоторых производных 1,4-

бензодиазепинов и их метаболитов приведены в таблице 4.

        Таблица 4

Спектральные характеристики некоторых производных
1,4-бензодиазепинов и их метаболитов
Нативное вещество, метаболит Растворитель Максимум поглощения,
нм
Хлордиазепоксид Этанол 245, 262
0,1М раствор HCl 245, 310

0,1М раствор NaOH       261

N-деметил-2-хлордиазепоксид Этанол 242, 263

0,1М раствор HCl        246, 310

0,1М раствор NaOH       258

2-амино-5-хлорбензофенон Этанол 237, 392

0,1М раствор HCl        260

0,1М раствор NaOH       -

Диазепам Этанол 230, 255

0,1М раствор HCl        241, 285, 360

0,1М раствор NaOH       229

Нордиазепам Этанол 228, 325

0,1М раствор HCl        237, 282, 370

0,1М раствор NaOH       340

3-гидроксидиазепам Этанол 231, 255, 315

0,1М раствор HCl        235, 283, 355

0,1М раствор NaOH       -

39      

2.7. Подтверждающие методы исследования
ИК-спектроскопия

Легкоинтерпритируемые ИК-спектры получаются при работе с растворами в четыреххлористом углеводороде. Однако низкая растворимость в нем многих бензодиазепинов не всегда позволяет получать такие спектры. Спектры, получаемые из кристаллических образцов бензодиазепинов таблетируемых с калия бромидом, как правило, сложнее вследствие межмолекулярных взаимодействий. В них достоверное отнесение можно сделать только для некоторых характеристических полос. В таблице 5 приведены основные характеристические частоты ИК-спектров производных бензодиазепинов.

Таблица 5

Основные характеристические частоты ИК-спектров производных
бензодиазепинов
хлордиазепоксид диазепам нитразепам оксазепам тип колебаний связь

1700 1710 1706 N − H валентная

1625 1680 1685 1687 C = O валентная

1590 1578 NO2 валентная

1260 1255 Cap− H деформационная

850 840 830 Cap− Cl деформационная

760 740 748 Cap− H валентная

690 705 693 Cap− Cl валентная

Газовая хроматография

Химическая структура многих анализируемых веществ, особенно полярность, если присутствуют гидрокси- и аминогруппы, может ограничить эффективность газовой хроматографии. Поэтому используется техника дериватизации. Описаны силильные, ацильные и алкильные производные. Высокие концентрации бензодиазепинов (при введении в хроматограф 1–2 мкл) могут быть определены без дериватизации.

40

Силильные производные имеют преимущества в масс-спектрометрии в связи с тем, что дают стабильные ионы с высокими молекулярными массами. Однако, силилированные экстракты из биологического материала имеют тенденцию быть грязными и поэтому не годятся для азотно-фосфорного детектора (АФД). Силилирование не усиливает отклик электронно-захватного детектора (ЭЗД).

Ацилирование и алкилирование гидрокси- и аминопроизводных осуществляют пропионил хлоридом и пропилиодидом, соответственно. Ацилирование/алкилирование имеет преимущество в связи с тем, что производные могут в дальнейшем перед анализом подвергаться процедурам очистки.

Насадочные колонки

⦁ газовой хроматографии бензодиазепинов на набивных колонках имеется большой выбор стационарных фаз. Годятся любые умеренные неполярые фазы, такие как диметилсиликон (OV-1, OV-30) или 50 %

фенилсиликон, 50 % метилсиликон. Длина и внутренний диаметр, хотя и влияют на величины удерживание веществ, могут отличаться от рекомендованных при условии хорошо подобранных аналитиком хроматографических условий и контроле специфичности, воспроизводимости и других параметров метода.

Газовая хроматография на насадочных колонках имеет ограниченную чувствительность и, поэтому, подходит только для анализа высоких концентраций в пробах гидролизованной мочи.

Капиллярные колонки

Подобно газовой хроматографии на насадочной колонке выбор капиллярных колонок в отношении стационарных фаз, толщины пленки, размера и типа колонки велик. Каждая колонка должна быть проверена, подходит ли она для данного анализа и метод должен быть проверен в отношении специфичности, воспроизводимости и других показателей. Большинство диметилсиликоновых и недериватизированных экстрактов или 5
41

⦁ фенилметилсиликоновых колонок могут быть использованы для анализа дериватизированных.

Детекторы

Для анализа бензодиазепинов методом газо-жидкостной хроматографии рекомендуются электронно – захватный детектор (ЭЗД) и азотно-фосфорный

(АФД) детектор, (часто именуемый азотно-селективным детектором). Пламенно-ионизационный детектор (ПИД), как правило, недостаточно чувствителен для анализа бензодиазепинов. Масс-селективные детекторы, такие как масс-спектрометры или ионные ловушки часто применяются в комбинации с капиллярной газовой хроматографией.

Относительное время удерживания производных бензодиазепинов на капиллярной колонке приведены в таблице 6.

Таблица 6
Относительное время удерживания производных бензодиазепинов на
капиллярной колонке
Бензодиазепины Относительные времена удерживания*

хлордиазепоксид 1,025

Диазепам 1,000

Нитразепам 1,159

7-аминонитрозепам 1,148

Нордазепам 1,034

Оксазепам 0,943

*Относительно диазепама

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией

Хроматомасс-спектрометрия является высоко специфичным подтверждающим методом для анализа бензодиазепинов.

Для идентификации бензодиазепинов ГХ/МС необходимо снимать спектры полного ионного тока (в режиме полного сканирования). Идентификация проводится на основании сравнения времени удерживания для

42

не менее трех основных (характеристических) ионов со стандартными

веществами.

Масс-спектрометрические характеристики некоторых производных

бензодиазепина, продуктов их гидролиза и дериватов приведены в таблице 7.

Таблица 7
Масс-спектрометрические характеристики производных бензодиазепина,
продуктов их гидролиза и дериватов
Диазепам Плазма, моча 284, 283, 256, 221, 77

2-метиламино-5- Моча после ферментативного или 245, 228, 193, 105, 77
хлорбензофенон кислотного гидролиза
Феназепам Моча после ферментативного или 350, 348, 321, 313, 177
кислотного гидролиза
Феназепам TMS 422, 420, 405, 385, 73
2-амино-2/-бромо-5- Моча после ферментативного 311, 309, 276, 274, 195
хлорбензофенон гидролиза
Нитразепам Моча, плазма, моча после 281, 253, 234, 222, 206
кислотного гидролиза
Нитразепам TMS 353, 352, 338, 306, 73
2-амино-5- Моча после кислотного гидролиза 242, 241, 195, 105, 77
нитробензофенон
Нордазепам Плазма, моча 270, 269, 242, 241, 77
Нордазепам TMS 342, 341, 327, 269, 73
2-амино-5- Моча после гидролиза 231, 230, 154, 105, 77
хлоробензофенон
Оксазепам Плазма, моча после гидролиза 268, 239, 233, 205, 77
глюуронидазой
Оксазепам 2TMS 430, 429, 340, 313, 73
Оксазепам TMS 356, 341, 312, 239, 135

Жирным шрифтом выделены характеристические ионы TMS – триметилсилированные производные

Высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ применяется для количественного определения бензодиазепинов. Значение этого метода для скрининга противоречиво из-за воспроизводимости времен удерживания от колонки к колонке и зависит от ряда факторов. Для анализа бензодиазепинов в биологических пробах используются обращено – фазные колонки.

Подвижные фазы – кислые, смесь фосфатного буфера и ацетонитрила и/или метанола. Важно контролировать рН подвижной фазы, т.к. небольшая

43

разница значительно влияет на результаты хроматографии. Для сложных смесей бензодиазепинов или при анализе неизвестного, необходим градиентный анализ или комбинация изократических систем. Большинство бензодиазепинов определяют при 230 нм, нитробензодиазепины при 240 нм. Для лучшей идентификации требуется диодно – матричное детектирование.

Вещества, которые приходится искать в крови или плазме, отличаются от веществ, находящихся в моче. Перед ВЭЖХ анализом бензодиазепинов требуется ферментативный гидролиз. Условия ВЭЖХ анализа бензодиазепинов

⦁ моче подобны условиям анализа крови и плазмы, но оптимизированы для анализа полярных метаболитов.

2.8. Интерпретация результатов анализа

Концентрация бензодиазепинов и их метаболитов в моче не может быть связана с принятой дозой вещества, так как зависит от объема выделяемой жидкости, креатининового клиренса (функции почек), времени, прошедшего после приема и индивидуальных особенностей метаболизма отдельных лиц. По концентрации бензодиазепинов в моче едва ли можно судить об отравлении бензодиазепинами. В моче бензодиазепины и их метаболиты находятся почти полностью, как глюкурониды, плохо экстрагируемые растворителями.

Оксазепам является наиболее часто встречающимся метаболитом многих бензодиазепинов. Поэтому, если не обнаружены специфические метаболиты, то невозможно установить, какой бензодиазепин был принят. Триазоло- и нитро – бензодиазепины образуют специфические метаболиты.

Для получения надежных результатов необходимо установить нативное вещество в крови и тканях внутренних органов.

Кровь (или сыворотка или плазма) являются наиболее важными объектами для оценки степени интоксикации. Однако при интерпретации результатов следует учитывать толерантность, наличие сопутствующих заболеваний, одновременный прием других средств, подавляющих ЦНС (алкоголь, наркотики) Так как бензодиазепины чаще всего в крови находятся в
44

очень низкой концентрации, кровь не всегда является оптимальным объектом для обнаружения бензодиазепинов. Предпочтение отдается моче для многочисленных иммунологических и хроматографических методов скрининга.

Период времени, в течение которого можно обнаружить в биологических объектах бензодиазепины, зависит от ряда факторов, включая дозу препарата, различия в метаболизме и выведении различных бензодиазепинов, хроническое или острое введение, одновременный прием других веществ, которые могут ослаблять или усиливать метаболизм и, наконец, зависит от применяемой аналитической методологии. Как правило, бензодиазепины могут быть обнаружены в моче приблизительно в течение периода от 24-48 часов после приема бензодиазепинов короткого действия до семи дней и более для препаратов среднего и длительного действия.

  1. СНОТВОРНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

3.1. Общая характеристика производных барбитуровой кислоты

50–60-е годы XX века характеризуются пиком злоупотребления барбитуратами. За последние десятилетия терапевтическое значение барбитуратов постепенно снижается за счет появления новых более эффективных, безопасных, обладающих меньшей толерантностью лекарств, например бензодиазепинов. Снижению частоты использования барбитуратов способствует большое количество побочных эффектов при их совместном приеме с другими веществами, воздействующими на ЦНС, наркотиками и алкоголем.

В соответствии с Конвенцией ООН о психотропных веществах 1971 г. международному контролю подвергается 12 барбитуратов: аллобарбитал,

амобарбитал, барбитал, бутабарбитал, буталбитал, циклобарбитал,

метилфенобарбитал, пентобарбитал, фенобарбитал, секбутабарбитал, секобарбитал и винилбитал.

45

По своему химическому строению барбитураты разделяется на диалкил-циклические производные мочевины (барбитураты) и N-ацилциклические амиды.

Общая формула барбитуратов

H O

N R
3

O 5
1 R
N
H O

Родоначальником этой группы веществ является барбитуровая кислота, образующаяся при конденсации мочевины и малоновой кислоты. При замене двух атомов водорода при углероде в положении 5 различными радикалами получаются многочисленные барбитураты, называемые 5,5′-дизамещенными барбитуратами. В некоторых случаях, например в метилфенобарбитале, атом водорода у азота в положении 1 может быть замещен алкильной группой. Тиобарбитураты это производные барбитуровой кислоты, у которых атом кислорода, присоединенный к углероду в положении 2, замещен серой. Все заместители оказывают значительное фармакологическое действие и влияют на распределение барбитурата в организме. Например, значения рКа барбитуратов, обладающих снотворным свойством, располагаются в пределах 7,78–8,30, т.е. при физиологических значениях рН (около 7,4) эти вещества примерно на 50 % недиссоциированы и легко проходят через различные барьеры организма, оказывая воздействие.

Производные барбитуровой кислоты используются как в виде солей, так

⦁ в виде свободных кислот. Последние растворимы в большинстве органических растворителей, таких, как этиловый эфир, этилацетат, хлороформ

⦁ метанол, но нерастворимы в воде. В виде натриевых солей производные барбитуратов хорошо растворимы в воде и нерастворимы в органических
растворителях.
H O
C2H5
N
Фенобарбитал (5-этил-5-фенилбарбитуровая кислота) O

46  NH      O   

Синонимы: Люминал.
Барбамил (5-изоамил-5-этилбарбитурат натрия) O

Синонимы: амитал-натрий, N C2H5
NaO CH3

амобарбитал-натрий, N CH2 CH2 HC
H O CH3
амилобарбитал-натрий.

            H   O   

Бензонал (1-бензоил-5-фенил-барбитуровая кислота) N C2H5

     O           

            N       
                O   
            O       

Гексенал (1,5 – диметил – 5 – ( циклогенсен – 1 – ил )

барбитурат натрия )

O
N CH 3

NaO

N

    O   O   
        CH3 

Тиопентал натрия
N C2H5
NaS
N CHCH2 CH2 CH3
H
O CH3

Этаминал натрия (5-Этил-5-(2-амил)-барбитурат натрия)

Синонимы : Нембутал .

H O

N CH3
NaO
N CHCH2 CH2 CH3
O CH3

Барбитал (5,5-диэтилбарбитуровая кислота) H O

Синонимы: Веронал. N C2H5
O
N C2H5
H O

Бутобарбитал (5-бутил-5-этил-барбитуровая кислота) O
N C2H5
47 HO

NH  CH2CH2   CH2    CH3 

O

3.2. Фармакологическое действие барбитуратов

⦁ медицинской практике барбитураты используются как снотворные и седативные препараты (фенобарбитал), при лечении эпилепсии в качестве антиконвульсантов (фенобарбитал), как внутривенные анестезирующие средства (тиопентал), в качестве антагонистов для подавления побочного действия стимуляторов.

⦁ барбитуратов наблюдается значительные различия в фармакокинетике

⦁ путях биотрансформации, которые связаны с липофильностью и скоростью метаболизма конкретного вещества. Липофильные барбитураты, например наркотически активные тиобарбитураты или N-моноалкилбарбитураты типа гексобарбитала имеют очень короткую продолжительность действия.

По длительности снотворного действия барбитураты делятся на барбитураты длительного действия (веронал, фенобарбитал), барбитураты средней продолжительности действия (амобарбитал, циклобарбитал),

короткого действия (тиопентал, гексобарбитал).

Длительное употребление барбитуратов или употребление их вместе с другими веществами, действующими на ЦНС, например наркотиками или алкоголем, приводит к индукции ферментов, отвечающих за их метаболизм. Этим обусловлено развитие толерантности. Она развивается обычно в период от нескольких недель до месяцев при постоянном приеме. Важно отметить, что толерантность не приводит к повышению концентрации вещества в крови, од-нако она может вызвать токсические эффекты.

Прием барбитуратов в больших дозах оказывает наркотическое опьяняющее действие, подобное алкогольному. Признаки его включают

эйфорию с эмоциональной неустойчивостью, вспыльчивостью, расторможенностью и агрессивностью. Другие признаки: гиперемия кожных покровов и склер, гипотония, брадикардия, снижение температуры тела, тонкий коричневатый, спаянный с эпителием налет на языке, гипосаливация, угнетение безусловных вегетативных рефлексов, мидриаз, расстройства координации, мышечная слабость, атактические расстройства (неуверенность походки,
48

пошатывание при ходьбе, падение, неточные, порывистые, размашистые движения, множество лишних движений). Завершается опьянение общей слабостью и сном.

Барбитуровая абстиненция характеризуется развитием тяжелых, опасных для жизни расстройств. Абстинентный синдром развивается в течение первых суток с момента последнего приема снотворного. Длительность абстиненции до 4-5 недель.

Признаки абстиненции: озноб, повышение температуры тела и артериального давления, тахикардия, недостаточность сердечно-сосудистой системы, боли в желудке, стул частый, жидкий, с тенезмами, тошнота, возможна многократная рвота; отличительный признак, не встречающийся при других видах наркоманий и токсикомании, ‒ боли в крупных суставах (коленных, локтевых, плечевых), боли в мышцах, сон и аппетит нарушены, гипергидроз, сальность кожных покровов, головокружение, общий тремор пальцев рук, преобладание злобно-тоскливого настроение, беспокойны, не находят себе места, постоянно меняют позу, возможно развитие типичной тяжелой депрессии с суицидальными тенденциями.

Основные симптомы барбитуромании:

1) отсутствие снотворного действия терапевтических доз, потребность в увеличении снотворной дозы; нарушения сна (укороченный поверхностный сон) вне приема препарата;

1) психическийдискомфорт вне приема барбитуратов (неудовлетворенность, пониженное настроение, навязчивые мысли, страхи, астения с непереносимостью звуков, шумов, света);

1) потребность в регулярном приеме; утренний, дневной прием барбитуратов.

Меры скорой помощи включают промывание желудка, многократный

прием активированного угля и другие подходы для дезактивации

гастроинтестинальной системы, внутривенное введение жидкости, форсированный диурез и алкалинизация. Алкалинизация мочи создается
49

внутривенным капельным введением раствора гидрокарбоната натрия до 1,5–2

⦁ в сутки под контролем определения щелочной реакции мочи и резервной щелочности крови. В тяжелых случаях используют гемодиализ.

Смерть от передозировки происходит обычно в результате остановки дыхания.

3.3. Токсикокинетика и биотрансформация

Практически все барбитураты метаболизируются до неактивных метаболитов, которые затем выводятся с мочой. Известно 4 основные пути метаболизма этих веществ:

1) окисление заместителей при С5 атоме углерода с образованием спиртов, фенолов, кетонов и карбоновых кислот с последующим частичным преобразованием их в глюкурониды на второй стадии метаболизма;

1) деалкилирование N-алкильных групп;

1) десульфулирование S-rpynnы тиобарбитуратов;

1) раскрытие барбитурового кольца между N1- и С6-атомами.

1) примеры окисления барбитуратов (первая стадия метаболизма)

H O H O

N C2H5 O N C2H5

O NH

N C2H5 CH2 CH2 OH

H O
O
O OH
H N CH3

N CH3

NaO NaO

N CH CH2 CH2 CH3 N HC CH2 CH CH3

                                                                             H       OH                              

            O                                                                                                           OH      
                                                                                                            CH3                 
                CH3                                                                                                 


            O                                                                                       H       O                               

                                                                                                    N           C2H5                        

N
C2H5

NaO CH3 NaO CH3
N
CH2 CH2 C

N CH2 CH2 HC 50
O
H HO CH3
O CH3

    O           H   O           

                N       C2H5        

N
C2H5
NaO
CH3
NaO CH3 N
N CH2 CH2 HC CH2 CH2 C
O
H O CH3 HO CH3

    O       H   O               
H                               
        C2H5    N       C2H5            
N                               

O O

NH          N                   
            H                   
    O           O               

OH
2) пример деалкилирования N-алкильных производных (первая стадия метаболизма)

    CH3 O                   O   

    N   C2H5                NH  C2H5    
                O               

O N C6H5 N C6H5

    H   O               H   O   

3) пример десульфирования (первая стадия метаболизма)

        O                                               O   
                                                    N                                       
    N   C2H5                                                C2H5    
                                HO                  

NaS

    N               CH2     CH2     CH2     CH3 N           CH2     CH2     CH2     CH3 


    H   O                                           H   O   
        CH3                                             CH3 

4) пример раскрытия цикла (первая стадия метаболизма)

O       O

NH C2H5 NH C2H5
O O
N C2H5 N C2H5
H O H O

51

Примеры второй стадии метаболизма (реакции синтеза с глюкуроновой

кислотой) O
H O NH C2H5
О-глюкурониды C2H5 O
N

O           N           
N           H   O       

                    O   
H   O                   
                    COOH    

        OH          O   
                    OH  
                HO  
                    HO  

N-глюкурониды H O O

    N   C2H5        NH  C2H5    

O           O           
    NH      HOOC    N       
        O           O   

            O           
            OH          
            HO          
            HO          

Время детектирования барбитуратов в биологических жидкостях, главным образом в моче, изменяется в значительных пределах. Это связано зависит от ряда причин: принятой дозы и продолжительности употребления (хронической или острой интоксикации), совместного употребления веществ, стимулирующих или подавляющих метаболические превращения (осо-бенностей токсикокинетики), используемого метода обнаружения конкретного определяемого вещества, рН мочи. Производные барбитуровой кислоты короткого действия, например пентобарбитал и секобарбитал, могут быть обнаружены в моче в течение 24 ч, вещества длительного действия, такие как фенобарбитал, ‒ в течение 14 дней и более. В других объектах период детектирования может быть более продолжительным, например в волосах барбитураты обнаруживаются после разовой терапевтической дозы спустя 6 месяцев и более. Терапевтические и токсические концентрации барбитуратов в крови приведены в таблице 8.

52

    Таблица 8

Терапевтические и токсические концентрации барбитуратов в крови

Вещество Максимальная терапевтическая Минимальная токсическая
концентрация, мг/л концентрация, мг/л
Барбитал 30 20

Буталбитал 10 10

Бутабарбитал 15 14

Фенобарбитал 40 30

3.4 Пробоподготовка исследуемого материала

Выделение барбитуратов из биологических жидкостей таких, как моча и кровь, обычно проводятся в несколько этапов: разрушение конъюгатов анализируемых веществ, если это необходимо; выделение аналита и его метаболитов из образца; проведение дериватизации, если это необходимо. При определении барбитуратов обычно нет необходимости в проведении гидролиза конъюгатов (или конъюгатов их метаболитов). Этим барбитураты отличаются от многих других токсикантов.

При исследовании цельной крови или плазмы крови необходимым этапом является осаждение из них белков, которое, как правило, проводится либо растворителем, например ацетоном или ацетонитрилом, либо каким-либо электролитом. Последнее предпочтительнее в связи с возможным эффектом высаливания, увеличивающим степень экстракции вещества при ЖЖЭ. Выделение барбитуратов из полученных водных растворов обычно осуществляется с помощью ЖЖЭ или ТФЭ. ЖЖЭ барбитуратов из мочи и плазмы крови проводится с применением различных органических растворителей при слабокислом значении рН – дихлорметана, диэтилового эфи-ра, толуола, этилацетата, гексана и других растворителей, а также их смеси. В последнее время наблюдается тенденция отказа от применения токсичного хлороформа. Получаемые при этом экстракты достаточно чисты и не требуют дополнительной очистки. При ТФЭ для барбитуратов чаще всего используют

53

колонки с обращено-фазовыми силикагелями С8 (или С18) или полимерными сорбентами.

Выделение барбитуратов из биологического материала. Методы выделения барбитуратов из секционного материала были разработаны и внедрены в практику уже много десятилетий назад. С некоторыми модификациями они с успехом применяются до сих пор.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной щавелевой кислотой. Оптимальные условия изолирования барбитуратов из биологического материала водой, подкисленной щавелевой кислотой, и способ очистки полученных вытяжек разработала М. Д. Швайкова с сотрудниками. Согласно этому методу, в коническую колбу вносят 100 г тщательно измельченных органов трупов, прибавляют 200 мл воды, подкисляют насыщенным водным раствором щавелевой кислоты до рН=2 и оставляют на 2 часа при частом перемешивании. Затем содержимое колбы переносят в стакан для центрифугирования вместимостью 500 мл и центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку и проверяют рН этой жидкости. В случае необходимости жидкость доводят до рН=2. Содержимое делительной воронки взбалтывают с тремя порциями хлороформа (по 20, 15 и 15 мл) в течение 5 мин. Если образуется эмульсия, то ее разрушают

центрифугированием. Хлороформные вытяжки соединяют, доводят хлороформом до 50 мл и переносят в делительную воронку, в которую прибавляют 25 мл 0,1М раствора NaOH, и взбалтывают. Водную фазу отделяют от хлороформной вытяжки. Эту вытяжку взбалтывают с двумя порциями воды по 1,5 мл. Первую и вторую порции воды (по 1,5мл), которыми промывали хлороформные вытяжки, присоединяют к щелочной водной фазе. Потом водную фазу подкисляют HCl до рН=2, вносят в делительную воронку и взбалтывают с двумя новыми порциями хлороформа (по 20 мл) в течение 5 мин. Хлороформные вытяжки соединяют и доводят хлороформом до 50 мл. В

54

этих вытяжках определяют наличие и количественное содержание барбитуратов.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной кислотой. Метод выделения барбитуратов из биологического материала, основанный на изолировании этих веществ водой, подкисленной серной кислотой, разработала В. И. Попова. Согласно этому методу, биологический материал настаивают с водой, подкисленной серной кислотой (рН=2). Полученные вытяжки освобождают от примесей методом гель-хроматографии. Для этой цели используется гель сефадекса G-25.

В стакан вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 80 мл 0,02 М раствора H2SO4, перемешивают и проверяют рН среды. При необходимости смесь доводят до рН=2 (по универсальному индикатору) 30 %-м раствором H2SO4. Смесь биологического материала и подкисленной воды настаивают в течение 2 ч при частом перемешивании. Затем вытяжку сливают, а биологический материал еще 2 раза настаивают с новыми порциями 0,02 M раствора H2SO4 (по 80 мл) в течение 1 ч. Кислые водные вытяжки соединяют, процеживают через сложенную в три слоя марлю

⦁ центрифугируют в течение 25–30 мин. Надосадочную жидкость

(центрифугат) сливают с осадка и очищают от примесей методом гель-хроматографии. Этот метод обеспечивает хорошую очистку барбитуратов, выделенных из биологического материала. После очистки вытяжек из биологического материала с помощью метода гель-хроматографии получают большие объемы элюатов, в одном миллилитре которых содержатся малые количества барбитуратов. Поэтому барбитураты, находящиеся в элюатах, подвергают экстракционному концентрированию. С этой целью объединенные кислые элюаты 3 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 50 мл)

⦁ течение 7 мин. Хлороформные вытяжки, полученные после каждой экстракции, соединяют и на водяной бане при 70 °С отгоняют из них 120–130

мл хлороформа. Оставшуюся упаренную хлороформную вытяжку при комнатной температуре выпаривают досуха. Сухие остатки используют для
55

идентификации и количественного определения барбитуратов при помощи соответствующих реакций и методов.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой. Подщелоченную воду для изолирования барбитуратов из биологического материала впервые применил П. Валов. Для осаждения примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки, он использовал вольфрамат натрия. В настоящее время известно несколько модификаций метода Валова. Приводим одну из них, предложенную М.Д. Швайковой и соавт.

⦁ стакан или коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10 % раствора гидроксида натрия. Содержимое стакана (или колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30 мин (3000

об/мин). От осадка отделяют надосадочную жидкость (центрифугат), к которой прибавляют 120 мл 10 % раствора вольфрамата натрия и 1 М. серной кислоты (рН 2,0). Жидкость нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, а затем подвергают центрифугированию в течение 30 мин. Центрифугат сливают

⦁ осадка и процеживают через ватный тампон, смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. Тампон промывают водой (10 мл).

Промывную воду тоже выливают в делительную воронку. К процеженной жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин. Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10 % раствора гидроксида натрия. Щелочной водный слой отделяют, подкисляют 25 % раствором серной кислоты до рН 2,0 и взбалтывают с равным объемом диэтилового эфира. Полученную при этом эфирную вытяжку используют для обнаружения и количественного определения барбитуратов.

Выделение барбитуратов из слюны, пота и волос. Слюна, пот и волосы являются альтернативными объектами исследования по сравнению с традиционными объектами – мочой и кровью. Исследование таких объектов стало возможным после внедрения в практику современных вы-сокочувствительных методов.
56

Эти объекты по сравнению с кровью и мочой отличаются значительно меньшим количеством биоматериала, который можно отобрать у конкретного человека. Концентрация определяемых веществ в них гораздо ниже по сравнению с мочой, а интервал времени, в течение которого можно детектировать барбитураты в слюне и поте, очень короткий.

Исследование слюны применяется при изучении токсикокинетики барбитуратов. Пот как объект исследования имеет ряд преимуществ при расследовании причин отравления, а также тестировании лиц на прием наркотиков. Волосы ‒ это единственный объект, позволяющий проводить исследование динамики потребления вещества в течение длительного времени.

Образцы пота отбираются на марлевый или ватный тампон, смоченный спиртом, или с помощью специальных устройств. Исследование слюны и пота после экстракции с использованного носителя или специального устройства проводится аналогично исследованию плазмы крови.

Особенностью исследования волос на барбитураты, как и на другие вещества, является необходимость перед выделением из них аналитов промывки внешней поверхности. Она необходима для удаления потожировых выделений, а также остатков веществ, выделившихся с потом. Такую промывку осуществляют в несколько этапов с применением воды и органических растворителей, например ацетона, эфира, дихлорметана, толуола. Чаще всего промытые волосы гомогенизируют различными способами и проводят либо энзиматический с применением глюкуронидазы/арилфосфатазы, либо кислотный гидролиз. После это аналиты выделяют с применением ЖЖЭ или ТФЭ. Исследование рассматриваемых объектов обычно осуществляется иммунными методами, методами ГХ-МС или ВЭЖХ-МС.

3.5. Предварительные методы анализа

Для определения барбитуратов применяются различные химические, физико-химические методы. Выбор конкретного способа пробоподготовки и метода определения зависит от целей и задач исследования, образца,
57

представленного на исследование, например неизвестный порошок или моча и

волосы человека, наличия оборудования и подготовленных сотрудников,

способных проводить исследование и интерпретировать полученные

результаты. Как минимум для установления факта присутствия барбитуратов в

различных объектах требуется получение результатов 2–3 независимыми мето-

дами. В число наиболее широко применяемых методов для определения

барбитуратов входят химические (хромогенные реакции), иммунохимические

тесты, УФ-ВИД-спектрофотомерия, ИК-Фурье-спектрометрия, ТСХ, ГХ и

ВЭЖХ, а также гибридные методы: ГХ-МС и ГХ- ИК-Фурье-спектрометрия,

ВЭЖХ-МС. До недавнего времени для анализа барбитуратов широко

использовались методы микрокристаллоскопии, однако в настоящее время они

применяются ограниченно.

Хромогенные (цветные) реакции

Цветные реакции известны давно и широко применяются при исследовании барбитуратов. С их помощью в анализируемом объекте обнаруживают вещества с определенной химической группой в структуре. Преимуществами цветных реакций являются дешевизна, отсутствие необходимости использовать дорогостоящее оборудование, быстрота получения результата, проведение многих тестов в течение нескольких минут и возможность проведения одновременно большого числа тестов.

Недостатками цветных реакций при анализе барбитуратов, как и других групп веществ, являются их недостаточная селективность, относительно низкая чувствительность и необходимость применять крайне ядовитые и высокоактивные реактивы, такие как соли ртути или серная кислота. Приведенные ниже тесты используются как для скрининга медицинских препаратов или неизвестных порошков, так и для тестирования экстрактов из биологического материала. Положительный результат обеспечивается присутствием, хотя и не обязательным, в тестируемом образце вещества, имеющего в своей структуре группировку, способную взаимодействовать с использованными реагентами. Результаты тестирования сильно зависят от

58

индивидуальной способности различать близкие оттенки цвета и профессиональной подготовленности специалиста.

Тест Дилле-Копани. Реакция с ацетатом кобальта (II) в среде метанола с добавлением изопропиламина. При наличии барбитуратов развивается фиолетовое окрашивание с различными оттенками. Предел обнаружения метода до 25 мкг в пробе.

Тест Либермана. Реакция с серной кислотой в присутствии нитрита натория. Фенобарбитал дает красно-оранжевое окрашивание, однако схожее окрашивание дают (желтые или коричневые интенсивные цвета) вещества, имеющие фенольные групп в молекуле.

Тест нитрата ртути. К насыщенному раствору нитрата ртути (I) добавляют бикарбонат натрия до окончания выделения газа и образования желтого осадка. Через некоторое время осадок меняет цвет на светло-коричневый. Используется только свежеприготовленный реактив (не более 1 ч). Темно-зеленое или черное окрашивание указывает на возможное присутствие вещества с имидной группировкой в кольце. Предел обнаружения барбитуратов от 1 до 5 мкг.

Иммунохимические тесты

При исследовании барбитуратов ИХМ используются для проведения скрининга большого числа образцов, главным образом биологического происхождения. Получаемые при этом результаты позволяют сделать предположение о возможном наличии в тестируемом объекте вещества из группы барбитуратов без проведения внутригрупповой дифференцировки. Про-должительность исследования обычно составляет от нескольких минут до нескольких часов. К настоящему времени отечественными и зарубежными производителями налажен выпуск наборов и реактивов для ИФА, метода поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА), метода ингибирования латексной агглютинации, радиоиммунных методов (РИА), а также иммунохроматографические наборы. На результаты тестирования оказывает влияние тип используемого растворителя, рН среды, интенсивность излучения

59

⦁ температура проведения анализа. Важнейшее значение имеет реакционная способность иммунных реактивов, которые достаточно быстро, особенно при несоблюдении правил их хранения, теряют свою активность. В связи с этим при проведении тестирования конкретного биообъекта, например мочи, важно придерживаться подробной инструкции от фирмы-производителя, в которой даны четкие рекомендации по степени разбавления реактивов и образца,

соотношению их объемов, условиях хранения реактивов и другая информация. Ложные результаты могут быть получены после чрезмерного разбавления образца, добавления в него кислот или щелочей, различных поверхностно-активных веществ, окислителей (перманганата калия или гипохлорита натрия)

⦁ других веществ. Иммунохимические тесты широко применяются при исследовании биологических объектов на присутствие в них барбитуратов,

однако полученные положительные результаты всегда требуют обязательного подтверждения другими методами.

Тонкослойная хроматография

ТСХ широко используется для исследования барбитуратов и большого числа веществ других групп – наркотиков, лекарств, пестицидов, метаболитов

этих веществ. ТСХ применяется для проведения скрининга. Хроматографирование барбитуратов обычно осуществляют на пластинах с закрепленными слоями силикагеля с добавлением флюоресцентного индикатора или без него на стеклянных, полимерных или металлических носителях.

На пластину наносят метанольные растворы исследуемых веществ или экстракты из биологических образцов. Одновременно на эти же пластины наносят растворы аналитических стандартов сравнения. Лучшие результаты получаются при использовании растворов в концентрации около 5 мг/мл.

Системы растворителей:

⦁ система А: этилацетат ‒ метанол ‒ 25 % раствор аммиака (85:10:5).

⦁ система В: хлороформ ‒ ацетон (80:20).

60

⦁ система С: изопропанол‒ хлороформ ‒ 25% раствор аммиака (90:90:20).

Пластины просматривают в УФ-свете при 254 и 366 нм и отмечают наличие хроматографических зон. Далее пластины обрабатывают реактивом хлорида ртути с дифенилкарбазоном. Барбитураты проявляются в данных условиях в виде сине-фиолетовых пятен на розовом фоне. Предел обнаружения составляет от 1 до 5 мкг барбитурата в пятне.

Другими проявляющими реагентами могут быть: 1) 1 % раствор ацетата серебра с последующей обработкой раствором дифенилкарбазона; 2) выдерживания пластин в атмосфере газообразного хлора после обработки их 2,7-дихлорфлюоресцином; 3) реактив Драгендорфа.

УФ-спектрофотометрия

Данный метод используется для проведения идентификации и количественного определения барбитуратов, в том числе выделенных из биологических объектов. В растворах барбитураты в зависимости от рН среды изменяют характер поглощения УФ-света. В кислой среде и органических растворителях поглощение барбитуратов незначительно. Однако при из-менении рН в их спектрах появляются интенсивные полосы поглощения вследствие лактим-лактамной таутомерии перехода лактамной формы барбитурата в лактимную при рН 9,0 (по N1 – С2) и при рН 13,0 (по N1 – С2 и по N3 – С4). Все 5,5-диацилзамещенные барбитураты в указанных условиях имеют максимум поглощения при рН 9,0 близкий 240 нм, при изменении рН до 13,0 интенсивность их поглощения снижается. При этом происходит сдвиг в более длинноволновую область к 255 нм. На рисунке показаны спектры поглощения барбитала в зависимости от рН среды.

61

Д

0,9 Спектр поглощения барбитала в

0,8 зависимости от рН среды
0,7
рН 2

0,6 рН 10

0,5 рН 13

0,4

0,3

0,2

0,1

0

220 230 240 250 260 270 280 нм

⦁ N-замещенных барбитуратов, например метилфенобарбитала, может быть только одна лактимная форма и на УФ-спектре, проявляется только один максимум поглощения при 243–244 нм при рН 9,0. Повышение рН до 13,0 к изменению спектра не приводит. Тиобар-битураты обладают высокой способностью к поглощению УФ-света. Максимум поглощения в сильнощелочной среде у них составляет 303–304 нм.

Окисленные в алифатической части метаболиты барбитуратов имеют очень близкие спектры к исходным барбитуратам, поэтому результат определения – это суммарная концентрация исходного вещества и его основных метаболитов.

УФ-спектрофотометрию используют для количественного определения барбитуратов в моче и крови при отравлениях.

Продукты реакции барбитуратов с дифенилкарбазоном и солями ртути поглощают УФ-свет при 550 нм. Это поглощение при концентрациях барбитуратов в плазме крови в диапазоне от терапевтических до токсических соответствует закону Бугера-Ламберта-Бера, что позволяет использовать реакцию для определения этих веществ фотоколориметрическим способом.

62

3.6. Подтверждающие методы

ИК-Фурье-спектрометрия

ИК-Фурье-спектрометрия применяют для идентификации индивидуальных барбитуратов. Метод недеструктивен и достаточно просто комбинируется с другими методами, например с ТСХ, обладает достаточно высокой чувствительностью: современные ИК-Фурье-спектрометры способны снимать спектры образцов вещества массой до 10 мкг, а при использовании специальных приспособлений и гораздо ниже.

Основные характеристические частоты ИК-спектров барбитуратов (см-1):

‒NH‒ (деформационные колебания) – 1680–1693;

‒С=0 (валентные колебания) – 1712–1725;

‒CONH‒ (валентные колебания) – 1744–1770;

=С‒N‒ (валентные колебания) – 1300–1320;

С=0 (деформационные колебания) – 1210–1245; =С‒Н (деформационные колебания) – 830–875.

Дополнительно тиогруппа может быть идентифицирована по 2 полосам поглощения – 1170 и 1540 см-1, фенильные заместители в положении 5 имеют полосы 1490 см-1 и между 690 и 715 см-1, аллильные радикалы – по полосам 1000 и 1540 см-1, N-метильные радикалы – по 2 полосам около 1190 см-1. В области «отпечатков пальцев» все барбитураты могут быть идентифицированы.

Газовая хроматография и хроматомасс-спектрометрия

Метод газовой хроматографии широко используется при исследовании барбитуратов, в том числе выделенных из биологических объектов. Современные капиллярные кварцевые газохроматографические колонки с нанесенными на стенки неполярными силиконовыми фазами достаточно инертны и позволяют проводить исследования следовых количеств барбитуратов без дериватизации. Однако в некоторых случаях, например при проведении подтверждающего исследования методом хромато-масс-

63

спектрометрии или при исследовании метаболитов барбитуратов дериватизация может быть полезна. С этой целью используют метилирующие реактивы, такие, как диазометан, гидроксиды тетраметиламмония или триметилфениламмония.

⦁ результате их действия атомы водорода у азота в молекуле барбитурата меняются на метильную группу. При исследовании метаболитов барбитуратов применяют различные ацилирующие реактивы, например ангидриды уксусной или трифторуксусной кислоты, либо многочисленные силилирующие реактивы.

Детектирование обычно осуществляется с применением ПИД, азотно-фосфорного детектора (АФД) или МС-детектора в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ или ИК-Фурье-детектора.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Использование ВЭЖХ для исследования барбитуратов как в лекарственных формах, так и выделенных из биологических объектов. Для этого чаще всего применяют обращено-фазовые колонки с сорбентами С8 или С18. В качестве подвижной фазы, используемой в изократическом или градиентном режиме, служат смеси ацетонитрила либо смеси метанола с водным буфером или смеси растворителей, например ацетонитрила, изопропанола и гексана, с фосфатным или ацетатным буфером. Лучшим выбором для детектирования барбитуратов можно считать УФ-детектор или диодную матрицу. В последнее время широкое распространение получили комбинированные методы жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Метод масс-спектрометрии в сочетании ГЖХ и ВЭЖХ

При анализе биологического материала метод масс-спектрометрии обычно сочетают с методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ГХ/МС и ВЭЖХ/МС), что позволяет максимально использовать возможности обоих методов, что повышает достоверность получаемых результатов. В неизмененном виде барбитураты имеют масс-

64

спектры, достаточно сложно поддающиеся идентификации. В связи с этим до недавнего времени с этой целью использовали метильные или диметилные производные барбитуратов. Масс-спектры некоторых барбитуратов приведены в таблице 9.

Методы ГХ/МС и ВЭЖХ/МС используются чаще всего при проведении арбитражного контроля т. к. относятся к достаточно дорогостоящим методам.

                                    Таблица 9
Масс-спектры некоторых барбитуратов

Вещество Молекулярная масса ионов (Д) и относительная интенсивность

Аллобарбитал 167 (100), 124 (97), 80 (68), 193 (23), 208 (2)

Амобарбитал 156 (100), 141 (73), 197 (9), 198 (6), 211 (2)

Барбитал 156 (100), 141 (97), 98 (22), 112 (20), 83 (12)

Буталбитал 168 (100), 167 (88), 181 (30), 141 (24), 209 (3)

Бутобарбитал 141 (100), 156 (96), 98 (19), 184 (10), 197 (2)

Винилбитал 157 (100), 83 (29), 71 (15), 209 (1), 195 (1)

Метилфенобарбитал 218 (100), 117 (39), 146 (23), 246 (10)

Пентобарбитал 156 (100), 141 (84), 69 (12), 98 (10), 197 (4)

Секбутабитал 141 (100), 156 (87), 57 (27), 98 (13), 157 (12)

Секобарбитал 168 (100), 167 (80), 195 (25), 141 (11), 209 (4)

Фенобарбитал 204 (100), 117 (29), 232 (23), 161 (20)

Циклобарбитал 207 (100), 141 (33), 236 (3), 81

Примечание. В скобках — относительная интенсивность, %.

65

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

Выберите один правильный ответ

  1. ОСНОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА ОБЛАДАЮТ СЛЕДУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ

1) хорошо растворяться в воде и хорошо растворяться в не полярных органических растворителях

2) хорошо растворяться в воде и хорошо растворяться в полярных органических растворителях
3) не растворяться в воде и не растворяться в органических растворителях
4) не растворяться в воде и хорошо растворяться в органических растворителях

  1. ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
    ГРУППОВОЙ РЕАКЦИЕЙ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНОТИАЗИНА
    ЯВЛЯЕТСЯ РЕАКЦИЯ С
    1) с нитритом натрия
    2) конц. серной кислотой

3) ацетатом кобальта
4) аммиаком

  1. ХИМИЧЕСКАЯ ФОРМУЛА ПРЕДСТАВЛЯЕТ 1) нативное вещество, производного фенотиазина
    2) метаболит, производного фенотиазина
    3) производное бутирофенона
    4) производное бензодиазепина

O

S

N Cl
CH3
CH2 CH2 CH2 N

                        CH3 
  1. ОСНОВНОЙ СПОСОБ ВЫВЕДЕНИЕ БАРБИТУРАТОВ ИЗ ОРГАНИЗМА 1) с выдыхаемым воздухом
    2) с мочой

3) с желчью
4) с потом

  1. УКАЖИТЕ, КАК ЗАВИСИТ ХАРАКТЕР СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ КРИВОЙ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН АНАЛИЗИРУЕМОГО РАСТВОРА С 9 ДО 13 ЕДИНИЦ

1) происходит смещение максимума поглощения в более коротковолновую область спектра

2) происходит смещение максимума поглощения в более длинноволновую область спектра

3) характер спектрофотометрической кривой практически не меняется от изменения рН раствора

  1. ГРУППОВЫМ РЕАКТИВОМ НА БАРБИТУРАТЫ ЯВЛЯЕТСЯ
    1) хлорид железа (III)

66

2) ацетат кобальта
3) конц. серная кислота
4) ацетат свинца

  1. МАКСИМАЛЬНОЕ ВСАСЫВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-
    БЕНЗОДИАЗЕПИНА ПРОИСХОДИТ
    1) в полости рта
    2) в желудке
    3) в тонком кишечнике
    4) в толстом кишечнике
  2. ПОДТВЕРЖДАЮЩИМИ МЕТОДАМИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ
    1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ЯВЛЯЮТСЯ
    1) хромогенные реакции
    2) иммуно-химические методы
    3) высокоэффективная жидкостная хроматография
    4) тонкослойная хроматография
  3. ДЛЯ ИЗОЛИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИСПОЛЬЗУЮТ 1) экстракцию подкисленной водой
    2) экстракцию органическим растворителем при рН>7
    3) экстракцию подщелоченной водой
    4) экстракцию органическим растворителем при рН<7

Укажите несколько правильных ответов

  1. ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНОТИАЗИНА ИМЕЮТ ЗАМЕСТИТЕЛИ В ПОЛОЖЕНИИ
    1) 1

1) 2
2) 9
3) 10

  1. МЕТАБОЛИЗМ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА ПРОИСХОДИТ СЛЕДУЮЩИМИ ПУТЯМИ
    1) ароматическое гидроксилирование в положение 3 и 6
    2) окисление гетероциклического атома серы
    3) N-деметилирование
    4) О-деметилирование

12 ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ТСХ – скрининга, ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНОТИАЗИНА МОЖНО ОБНАРУЖИТЬ НА ПЛАСТИНКЕ 1) при обработке реактивом Драгендорфа
2) при облучении УФ-светом

67

3) при обработке концентрированной серной кислотой
4) при обработке раствором дифенилкарбазона и солями ртути

  1. БИОТРАНФОРМАЦИЯ БАРБИТУРАТОВ В ОРГАНИЗМЕ СВЯЗАНА 1) с восстановлением барбитуратов
    2) с деалкилированием N-алкильных производных
    3) с десульфированием тиобарбитуратов
    4) с окислением заместителей при атоме углерода С5
  2. ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ТСХ БАРБИТУРАТЫ МОЖНО ОБНАРУЖИТЬ НА ПЛАСТИНКЕ ОБРАБОТАВ ЕЁ 1) реактивом Драгендорфа

2) раствором хлорида железа (III)
3) концентрированной серной кислотой
4) раствором дифенилкарбазона и солями ртути

  1. ДЛЯ ИЗОЛИРОВАНИЯ БАРБИТУРАТОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ 1) метод Валова

2) метод Крамаренко
3) метод Поповой
4) метод Швайковой

  1. ПРИПРОВЕДЕНИИСКРИНИНГАПРОИЗВОДНЫЕ1,4-

БЕНЗОДИАЗЕПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТСХ-СКРИНИНГА, ОБНАРУЖЕНИЕ ВЕЩЕСТВ НА ПЛАСТИНКЕ ПРОВОДИТСЯ 1) в УФ-свете

2) по реакции йодплатинатом калия
3) по реакции Браттона-Маршалла

4) по реакции с реактивом Фелинга
5) по реакции с FNP-реактивом

  1. ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА ИСПОЛЬЗУЮТ 1) ИХМ (имуннохимический метод)

2) ТСХ (тонкослойная хроматография)
3) ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)
4) ГХ/МС (газовая хроматография с масс-селективным детектором)

Тестовые задания со свободным выбором Дополните предложение

  1. ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИЕМЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНОТИАЗИНА ВСАСЫВАЮТСЯ В ОСНОВНОМ В ….

68

Дополните предложение

  1. ПРИ АНАЛИЗЕ МЕТАБОЛИТОВ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА ПРОВОДЯТ ГИДРОЛИЗ: КИСЛОТНЫЙ ИЛИ …

Дополните предложение

  1. ОСНОВНЫМ ОТЛИЧИЕМ ПРИ АНАЛИЗЕ КРОВИ НА БАРБИТУРАТЫ ОТ АНАЛИЗА МОЧИ НА БАРБИТУРАТЫ ЯВЛЯЕТСЯ ПРОЦЕСС ….

Исключите один лишний барбитурат из приведенного перечня.

  1. ФЕНОБАРБИТАЛ, БАРБАМИЛ, ЭТАМИНАЛ НАТРИЯ, БАРБИТАЛ НАТРИЯ.

Дополните предложение

  1. БАРБИТУРАТЫ ХОРОШО РАСТВОРИМЫ В ВОДЕ И ПЛОХО РАСТВОРИМЫ В НЕПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ В … ФОРМЕ.

Дополните предложение

  1. 5-ЭТИЛ-5/ -(N-ГИДРОКСИФЕНИЛ)-БАРБИТУРОВАЯ КИСЛОТА ЯВЛЯЕТСЯ МЕТАБОЛИТОМ ….

Дополните предложение

  1. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА НАКАПЛИВАЮТСЯ В ТКАНЯХ БОГАТЫХ ….

Дополните предложение

  1. ПРОИЗВОДНЫЕ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИНА И ПРОДУКТЫ ИХ МЕТАБОЛИЗМА В ОСНОВНОМ ВЫВОДЯТСЯ ….

Укажите название метаболита

  1. В РЕЗУЛЬТАТЕ РЕАКЦИИ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ И ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ДИАЗЕПАМА ОБРАЗУЕТСЯ АКТИВНЫЙ МЕТАБОЛИТ ….

Дополните предложение

  1. ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН РАСТВОРА ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-

БЕНЗОДИАЗЕПИНА ПРОИСХОДИТ ИЗМЕНЕНИЕ ХАРАКТЕРА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ КРИВОЙ Т.К. ДАННЫЕ ВЕЩЕСТВА ПРОЯВЛЯЮТ … СВОЙСТВА.

Тестовые задания на установления соответствия

  1. УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ ТОКСИКАНТОМ И ЕГО ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ К СООТВЕТСТВУЮЩЕМУ ПРОИЗВОДНОМУ

69

токсикант производное
А) галоперидол 1) производное бензодиазепина
Б) тиоридазин 2) производное бутирофенона
В) клозапин 3) производное фенотиазина
4) производное индола

29.УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ НАИМЕНОВАНИЕМ ПРОИЗВОДНОГО 1,4-БЕНЗОДИАЗЕПИНА И ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ ЕГО ПРЕВРАЩЕНИЯ

наименование продукт реакции
А) оксазепам 1) 2-амино-5-нитробензофенон
Б) нитразепам 2) 2-амино-5-хлоробензофенон
В) феназепам 3) 2-метиламино-5-хлоробензофенон
Г) диазепам 4) 2-амино-5-хлоро-2/-бромобензофенон
⦁ 2-метиламино-5-хлоро-2/-бромобензофенон

⦁ УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ НАЗВАНИЕМ И ФОРМУЛОЙ БЕНЗОДИАЗЕПИНА

название формула
А) диазепам H O H O
Б) нитразепам
N N

В) оксазепам OH
Г) феназепам

O2N N   Cl      N   


1)      2)          







H3C H   O   
O   N       
N           
Cl      N   

Cl N

4)      Br  

3)

70

ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

  1. 4 11. 1,2,3 21. фенобарбитал
  2. 2 12. 1,2,3 22. солевой
  3. 2 13. 2,3,4 23. фенобарбитал
  4. 2 14. 3, 4 24. липидами
  5. 2 15. 1,3,4 25. почками
  6. 2 15. 1,2,3 26. оксазепам
  7. 3 16. 3, 4 27. амфотерными
  8. 3 17. в тонком кишечнике 28. Б-1, В-2, А-3
  9. 1 18. ферментативный 29. Б-1, А-2, Г-3, В-4
  10. 2, 4 20. депротеинизация 30. В-1, А-2, Б-3, Г-4

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *