12. Выбор объекта исследования. Подготовка объектов. Характеристика объектов исследования. Правила направления объекта исследования на анализ. Условия транспортировки и хранения. Консервация.

Результаты химико-токсикологического анализа зависят от правильного выбора объектов исследования, соблюдения правил химико-токсикологического анализа биологического материала на наличие токсических веществ, правильного выбора методов исследования и некоторых других факторов.

Объектами химико-токсикологического анализа, подлежащими исследованию на наличие ядовитых веществ, могут быть органы трупов, моча и кровь трупов, рвотные массы, экскременты, волосы, ногти, промывные воды желудка, остатки пищи, напитки, пестициды, части растений, обработанные пестицидами, вода водоемов, пробы воздуха промышленных предприятий, почва, предметы домашнего обихода, одежда и др.

Частые объекты:

1. Моча – наиболее распространенный объект исследования на лекарственные токсичные соединения и наиболее простой биообъект для анализа вследствие низкого содержания белковых компонентов.

Важным показателем мочи как биообьекта является рН, поэтому работа с ней требует постоянного внимания к изменению рН. Пробоподготовка мочи может состоять из различных операций: прямое концентрирование (упаривание некоторого количества мочи до небольшого объёма на водяной бане либо роторном испарителе), экстракция растворителями, лиофилизация, хроматографическое разделение или

сорбция на твердом сорбенте или комбинация различных операций (концентрирование – экстракция, лиофилизация – экстракция и др.).

2. Кровь. Уровень токсических веществ и их метаболитов у живых объектов и в крови трупа неодинаков вследствие биохимических изменений. Содержание токсического вещества в артериальной или венозной крови также будет различным. Даже положение тела у живого пациента – стоя, сидя или лежа – влияет на биохимический состав пробы, так как в этом случае меняется содержание белков в крови, что особенно важно для токсических веществ, в значительной степени связывающихся с белками. Обработке экстракцией может быть подвергнута цельная кровь, плазма или сыворотка.

3. Слюна является продуктом секреции желез ротовой полости. Отобранную пробу центрифугируют и для хранения замораживают, чтобы замедлить активность ферментов. Хранить лучше всего слюну в склянках из тефлона или полипропилена, чтобы избежать поглощения следовых количеств анализируемого вещества стенками стеклянной посуды. Установлено, что неионизированные формы токсического вещества, находящиеся в водном растворе плазмы, пассивно диффундируют в слюну, так что существует прямая зависимость между концентрацией анализируемого вещества в слюне и его концентрацией в крови.

4. Волосы представляют относительно гомогенный биологический субстрат. Являясь легкодоступным для отбора, они представляют значительный интерес в качестве объекта при проведении химико-токсикологического анализа как на неорганические, так и на органические вещества. При анализе волос наркотики могут быть обнаружены в отдаленные сроки после окончания их приема и в тех случаях, когда анализ биожидкостей дает отрицательный результат. Использование волос в качестве объекта исследования позволяет проследить динамику поступления наркотического вещества в организм человека. Анализ волос длиной 6-8 см (6-8 месяцев) позволяет судить о степени наркотической зависимости.

5. Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза. В печени находится большое разнообразие экзогенных и эндогенных веществ: продукты белкового, углеводного, жирового обменов, продукты биотрансформации экзогенных, в том числе токсических веществ. С точки зрения присутствия эндогенных и экзогенных веществ в экстракте из печени этот объект является самым неудобным вследствие их большого разнообразия. Даже самая длительная и многоэтапная экстракция, например, кислых лекарственных средств дает в хлороформном экстракте до восьми разнообразных эндогенных соединений.

13 ТСХ-скрининг важнейших соединений

Схема проведения химико-токсикологического анализа не неизвестное вещество состоит из двух этапов:

1. Берется аликвота для исследования из объекта и проводится скрининг иммунохимическими или хроматографическими методами. Параллельно проводятся контрольные опыты

2. Отрицательный результат – при отсутствии данного вещества на уровне установленного предела определения; при получении положительного результата проводится подтверждающее исследование методами ГЖХ, ВЭЖХ, ИК, фармакологических проб, и проводится интерпретация результата.

В процессе хроматографического разделения вещества распределяются по хроматографическим зонам. Использование комплекса детектирующих групповых реагентов позволяет исключать классы, группы соединений. В результате область поиск сужается до наиболее вероятных ядов.

Общая схема проведения ТСХ-скрининга

1. Проведение ТСХ в общих системах растворителей

2. При положительном результате проведение ТСХ в частных системах растворителей

ТСХ-скрининг начинается с исследования в общей системе растворителей. Анализируемая проба распределяется в основную и контрольную зону. Основная зона последовательно проявляется серией групповых реагентов. В результате: некоторые группы веществ исключаются и остаются наиболее вероятные группы веществ, делается предварительное заключение.

На втором этапе проводится подтверждающее исследование. Для этого используют уже элюат, полученный из контрольной зоны пластинки. Элюат расходуется на: ТСХ-исследование в частной системе растворителей. Дальнейшее подтверждающее исследование на предполагаемый яд.

Критерии выбора общих и частных систем растворителей:

Общие системы характеризуются:

· высокой разделяющей способностью

· разделением анализируемых веществ на группы, локализованные в хроматографические зоны

· локализованным расположением большей части соэкстрактивных веществ вне зоны исследуемых веществ

Частные системы:

· высокая эффективность разделения исследуемых веществ, входящих в ту или иную хроматографическую зону

К общим системам растворителей относятся:

· для анализ соединений кислого, нейтрального и слабоосновного характера: ацетон:хлороформ (1:9)

· для анализа соединений основного, нейтроального и слабоосновного характера:

o ацетон:хлороформ:25%-аммиак:диоксан (5:45:2,5:47,5)

o метанол:конц.аммиак (100:1,5)

Частные системы растворителей для кислого, нейтрального, слабоосновного характера:

· ацетон:циклогексан (5:1) – для 1 хроматографической зоны

· хлороформ:бутанол:25%-аммиак (70:40:5) – для 2 хроматографической зоны

· этилацетат:бензол:этанол:25%-аммиак (95:15:5:1) – для 3 хроматографической зоны

Частные системы растворителей основного, нейтрального, слабоосновного характера:

· хлороформ:диэтиламин (9:1)

· хлороформ:ацетон (5:1)

· хлороформ:этанол (20:1)

· циклогексан:ацетон (5:1)

Обнаружение соединений кислого, нейтрального, слабоосновного характера

· просмотр в УФ-свете

· использование реагентов:

o 5%-раствор сульфата меди в конц. серной кислоте и 0,1% раствора дифенилкарбазона в хлороформе (обнаружение барбитуратов)

o 10%-раствор хлорида окисного железа (обнаружение фенотиазинов)

o модифицированный реактив Драгендорфа (обнаружение соединений, содержащих в структуре молекулы третичный атом азота) и 10%-раствор серной кислоты дл повышения чувствительности реактива Драгендорфа

Обнаружение соединений основного, нейтрального, слабоосновного характера:

· 10%-раствор хлорида окисного железа (обнаружение производных фенотиазинов, пиразолона)

· 10%-раствор серной кислоты и просмотр в УФ-свете (хинин)

· модифицированный реактив Драгендорфа (соединения, содержащие в структуре молекулы третичный атом азота

 

Вещества кислого, нейтрального и слабоосновного характера

Вещества основного, нейтрального и слабоосновного характера

Общие системы растворителей

ацетон:хлороформ (1:9)

 

• ацетон:хлороформ:25%-аммиак:диоксан (5:45:2,5:47,5)

• метанол:конц.аммиак (100:1,5)

 

Частные системы растворителей

• ацетон:циклогексан (5:1) – для 1 хроматографической зоны

• хлороформ:бутанол:25%-аммиак (70:40:5) – для 2 хроматографической зоны

• этилацетат:бензол:этанол:25%-аммиак (95:15:5:1) – для 3 хроматографической зоны

 

• хлороформ:диэтиламин (9:1)

• хлороформ:ацетон (5:1)

• хлороформ:этанол (20:1)

• циклогексан:ацетон (5:1)

 

Обнаружение

• просмотр в УФ-свете

• использование реагентов:

o 5%-раствор сульфата меди в конц. серной кислоте и 0,1% раствора дифенилкарбазона в хлороформе (обнаружение барбитуратов)

o 10%-раствор хлорида окисного железа (обнаружение фенотиазинов)

o модифицированный реактив Драгендорфа (обнаружение соединений, содержащих в структуре молекулы третичный атом азота) и 10%-раствор серной кислоты дл повышения чувствительности реактива Драгендорфа

 

• 10%-раствор хлорида окисного железа (обнаружение производных фенотиазинов, пиразолона)

• 10%-раствор серной кислоты и просмотр в УФ-свете(хинин)

• модифицированный реактив Драгендорфа (соединения, содержащие в структуре молекулы третичный атом азота)

 

14. Хроматографические методы исследования. Сравнительная характеристика методов с учетом целей химико-токсикологического анализа.

1.ГЖХ является одним из видов распределительной хроматографии, где в качестве подвижной фазы используется газ, а неподвижной – жидкость, нанесенная в виде тонкой пленки на гранулы твердого носителя, которым заполняется колонка. Разделение компонентов смеси основано на различии коэффициентов распределения этих компонентов между подвижной и неподвижной фазами, что приводит к различной скорости передвижения компонентов по колонке. Достоинства метода: Высокая разделяющая способность, что позволяет анализировать сложные многокомпонентные смеси. Это удобно в случаях комбинированных отравлений суррогатами алкоголя или наркотическими веществами. Универсальность метода. Анализировать можно любые соединения при условии их летучести и термостабильности. Возможность качественного и количественного определения в одной пробе. Высокая чувствительность . Точность метода (ошибка не превышает 1-2%). Экспрессность (время определения 3-5 минут) и возможность проведения, в связи с этим, серийных анализов. Простота и легкость выполнения. Доказательность и объективность.

2.ТСХ-Роль подвижной фазы выполняет смесь растворителей, неподвижной фазой являются сорбенты на пластинке, а для обнаружения токсических веществ на хроматограмме используются химические реагенты и УФ-свет. Преимущества :хорошая чувствительность,

высокая специфичность, быстрота анализа, простота выполнения, очистка от соэкстрактивных веществ, возможность сочетания с другими физико-химическими методами.

3. ВЭЖХ – позволяет анализировать водные растворы, сокращается время анализа, быстрое установление равновесия между подвижной и неподвижной фазами, отпадают ограничения по термоустойчивости, не требуется летучесть веществ. Применение специфических и неразрушающих методов детектирования позволяет, например, снимать электронные спектры отдельных фракций. К недостаткам ВЭЖХ можно отнести: малая чувствительность детекторов, ограниченные возможности спектрофотометрического детектора (180 – 700 нм), более дорогостоящая аппаратура и сложность заполнения колонок. ВЭЖХ- методики требуют значительных количеств высокочистых органических растворителей. Очистка растворителей в лабораториях весьма трудоемкий процесс, а очищенные растворители дорогие. Чувствительность метода определяется типом используемого детектора. Наиболее чувствительными являются флуоресцентный и МС-детекторы, наиболее универсальными – спектрофотометрический. Время удерживания – качественная характеристика, сравнивается со стандартом.

15. спектральные методы исследования. сравнительная характеристика методов с учетом целей химико-токсикологического анализа.

Существуют три варианта проведения ХТА
1)Направленный анализ объектов, содержащих известные токсичные вещества.2) Ненаправленный анализ Отсутствие каких-либо сведений о природе токсичного вещества.3) Вариант когда наличие косвенных сведений, указывающих на возможную причину отравления, гипотезы о химической природе токсичного вещества, построенная на основе клинической картины отравления пострадавшего и/или результатов патологоанатомического вскрытия трупа.

При проведении направленного анализа необходимо подтверждение наличия известного токсиканта в биосубстратах потерпевшего и определение количественного содержания токсиканта. В направленном анализе для выбора оптимальных условий анализа можно воспользоваться справочной информацией. Знание физико-химических свойств токсического вещества позволяют подбирать условия и технику проведения анализа. Как правило, для анализа в этом случае необходимо небольшое количество определенного биообъекта. Ненаправленный анализ требует скрининговой методики, поскольку необходимо охватить все подозреваемые вещества с самыми разнообразными физико-химическими свойствами. Это требует большого количества и разнообразие биообъектов, вспомогательных химических веществ и разнообразной техники. Скрининг — это поэтапное обнаружение групповой принадлежности токсиканта, а затем идентификация и количественное определение индивидуального токсичного вещества.

Скрининговые тесты имеют невысокую специфичность. Они применяются только для определения групповой принадлежности, возможно, присутствующего токсиканта. Во всех случаях проведения ХТА эксперт сталкивается с получением ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Первые связаны с недостаточной селективностью методов обнаружения, а вторые — с недостаточной чувствительностью выбранных методов анализа. Специфичность аналитического метода позволяет отличать химическую структуру определенного соединения от структуры ему подобных аналогов. Чувствительность прямо связана с пределом обнаружения — минимальной концентрацией или количеством вещества, которые можно определять данным методом с какой-то допустимой погрешностью. Ложноотрицателъный результат — это отрицательный ответ на присутствие подозреваемого вещества, полученный при исследовании объекта, содержащего это вещество.Причины: недостаточная чувствительность используемого метода, преднамеренная фальсификация пробы, недостаточная квалификация эксперта, системати-ческие ошибки исследования. Ложноположительный результат — это положительный ответ на присутствие подозреваемого вещества, полученный при анализе объекта, не содержащего это вещество. Причины: недостаточная специфич-ность метода, слабая профессиональная подготовка эксперта, систематические ошибки, загрязненные реагенты.

Выбор метода исследования определяется главной задачей ХТА — добиться минимума отрицательных и максимума положительных результатов при определении токсиканта в биообъектах. Выбор метода с низкой чувствительностью грозит не обнаружением искомого вещества (ложноотрицательный результат). Так как при отрицательном результате дальнейший поиск токсиканта не проводится. Результат имеет отрицательное судебно-химическое значение. Выбор метода с низкой селективностью обнаружения искомого вещества дает (ложноположительный результат), что не позволяет определить

конкретный токсикант. Это может послужить причиной неправильного заключения эксперта.

Выбор метода анализа Зависит от объекта анализа и вида токсиканта;Зависит от содержания токсиканта в объекте анализа;Зависит от цели анализа (Судебно-Химический Анализ (СХА), Клинико-Токсикологический Анализ (КТА), анализ наркотических и психотропных веществ.

Выбор метода В соответствии с требованиями надежности, достоверности и доказательности результатов анализа, а также по рекомендациям ВОЗ и общепринятым мировым стандартам, лабораторное исследование должно состоять из двух этапов: предварительного (скрининговое) и подтверждающего.

Предварительные методы анализа химический метод (цветные или хромогенные реакции) и микрокристаллоскопические реакции,ИммуноХимические Методы (ИХМ) (ИммуноХроматографический Анализ (ИХА) на тест-полосках, Поляризационный ФлуороИммуноАнализ (ПФИА) и ИммуноФерментный Анализ (ИФА),УФ-спектрофотометрия,

ТСХ

Предварительные методы анализа в целом отличаются достаточной простотой (не требуют специального оборудования), быстро выполнимы, не требуют предварительной обработки.

Отдельные предварительные методы отличаются высокой чувствительностью (иммунохимические методы, ТСХ) и селективностью (ТСХ).

Цветные реакции (чаще всего это групповой реактив) например на барбитураты с солями кобальта. Проводится для обнаружения искомых веществ в вещественных доказательствах (таблетки, порошок). Проведение микрокристаллоскопических реакций требует достаточно квалифицированного персонала.Недостатками химического метода является невысокая чувствительность и селективность, что затрудняет определение в биологическом материале.

ТСХ является наиболее часто используемым методом в ХТА.Использование «общих систем растворителей» позволяют определить групповую принадлежность токсиканта при обработки пластинки групповыми реактивами.Использование «частных систем растворителей» позволяют определить конкретный токсикант внутри группы. На пластинки параллельно с нанесенной пробой наносятся вещества свидетели и проводится разделение в определенной системе растворителей. Хроматограмму обрабатывают групповыми реактивами или просматриваются в УФ-свете. Результаты оцениваются по значению величины Rf , по величине и интенсивности пятен можно определить количественно содержание токсикантов (денситометрия). Метод ТСХ может быть использован для очистки вытяжки из биологического материала для дальнейшего исследования спектральными методами анализа. Недостатки метода ТСХ отсутствие стандартов метаболитов токсикантов, что не позволяет их определять. Метод ТСХ имеет отрицательное судебно-химическое значение, т.е. при получении отрицательного результата дальнейшее исследование другими методами не проводиться, а в отношении исследуемого образца делается заключение о том, что он контролируемых веществ не содержит.

Иммунохимические методы (имунноферментный анализ (ИФА) имуннохроматографический анализ (ИХА) тест полоски)

Данные методы отличаются высокой чувствительностью, простой, и экспрессностью исполнения, одновре-менно позволяют анализировать большое число проб, не требуя дополнительной или специальной их очистки или концентрирования. К недостаткам ИХМ можно отнести наличие перекрестно реагирующих веществ, которые могут дать ложноположительные результаты и то, что данный метод является групповым и не позволяет различать конкретные вещества.

УФ-спектрофотометрия

Обязательным условием использования данного метода является то, что для его использования вытяжка из биологичес-когоматериала должна быть максимально очищена в противном случае наличие посторонних веществ отражается на результатах количествен-ного определения, а результаты качественного анализа искажаются. Недостатки метода УФ-спектрофотометрии

Не для всех групп токсикантов может быть использован. Наличие в структуре токсиканта хромоформных групп является обязательным условием. Очистка извлечения приводит к потерям в случае использования метода для количественного определения.

Подтверждающие методы анализа ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/МС (газовая хроматография/ масс-спектрометрия), ВЭЖХ/МС,ИК-спектроскопия,ААС (атомно-абсорбционная спектроскопия).

Подтверждающие методы характеризуются:

• Более высокой селективностью по сравнению с предварительными методами;

• Чувствительность сопоставима с предварительными методами или выше;

• Возможностью количественной оценки токсиканта.

Метод газовой хроматографии быстрый анализ сложных смесей — от считанных минут до 1-2 ч; неразрушающий метод, легко объединяемый с другими физико-химическими методами анализа, например масс-спектрометрией.относительно недорогой метод (в сравнении с методом ВЭЖХ). Метод ГХ выше по эффективности разделения чем ВЭЖХ. Недостатки метода ГХ

применение метода ограниченно летучестью образцов (может использоваться после дериватизации образца), метод не подходит для термолабильных веществ.

На практики порядка для 20% проб можно использовать газовую хроматографию.

Метод ВЭЖХ Позволяет разделять полярные (метаболиты), термолабильные токсиканты;

быстрый анализ сложных смесей; неразрушающий метод, легко объединяемый с другими физико-химическими методами анализа, например масс-спектрометрией. применим для большинства токсикантов. Обычно используется в обращенно-фазовом варианте (разделение на неполярном сорбенте (модифицированный силикагель С18) с использование в качестве подвижной фазы полярного растворителя (ацетонитрил) в режиме градиентного элюирования. Качественной характеристикой в методах как ГХ так и ВЭЖХ является время удерживания вещества на колонке в сравнении с временем удерживания стандартного образца. Количественной характеристикой в методах как ГХ так и ВЭЖХ является площадь пика на хроматограмме в сравнении с площадью пика стандарта.

Масс-спектрометрия Анализируемые молекулы, последовательно ионизируются, получившиеся в результате этого ионы разделяются в зависимости от присущих им отношений массы к заряду и детектируются. Результатом этих процессов является масс-спектр, который несет в себе информацию о молекулярной массе аналита и его структуре.Метод масс-спектрометрии, в сочетании с хроматографическими методами занимает одно из ключевых положений в ХТА как метод арбитражного анализа, позволяющий проводить идентификацию неизвестных веществ и их количественное определение в широком диапазоне концентраций. К недостаткам методов ГХ/МС и ВЭЖХ/МС относят:Сложную и дорогостоящую аппаратуру;Наличие высококвалифицированного персонала.Данные методы используются в случае проведения арбитражного контроля в ведущих лабораториях.

ИК-спектрометрия метод анализа основанный на регистрации электромагнитного излучения атомами исследуемого вещества. Средняя область (400-4000 см-1) обычно используется в анализе. Каждое соединение имеет специфический ИК-

полное совпадение ИК спектров надежно идентифицирует исследуемое соединение. Недостатки метода ИК-спектроскопии

Является сложность интерпретации спектров поглощения.Предварительная очистка вытяжки.

Для использования необходимо иметь библиотеку ИК-спектров(проблема ИК-спектры метаболитов токсикантов).

Атомно-абсорбционная спектроскопия Вещество подвергают атомизации. В состоянии, которое называют атомным паром, атомы способны поглощать кванты проходящего через него резонансного излучения. В результате интенсивность излучения уменьшается и ее можно измерить. Индивидуальность линейчатых атомных спектров всецело определяется строением внешней электронной оболочки атомов и ее заполнением электронами. Метод ААС используют для обнаружения (наличие в спектре характерной полосы поглощения) и количественного определения (интенсивность полосы поглощения) тяжелых металлов. Метод отличается высокой чувствительностью и селективностью. Определение проводят после минерализации биологического материала.

Интерпретация результатовОб употреблении того или иного вещества может свидетельствовать присутствие метаболитов, которые могут быть одинаковыми у разных веществ;

Отрицательный результат может быть следствием того, что проба была взята слишком поздно после приема токсиканта; Пороговая чувствительность метода исследования может превышать порог возможного выявления вещества.Бывает невозможно отличить запрещенные соединения и разрешенные лекарственные средства из-за схожести структуры веществ. Некоторые тяжелые металлы содержатся в организме, ядами их делает повышенное содержание.

Очень важно обращать внимание на количественное содержания токсиканта. PS заключение о причинах смерти потерпев-шего дает врач-судмедэксперт основываясь на всем комплексе имеющихся данных:

1) результаты осмотра место обнаружения тела;

2) результатах вскрытия трупа в морге;

3) результатах проведенного судебно-химического анализа (обнаружения и количественного определения);

4) обстоятельствах уголовного дела (показания свидетелей и т.п.).

16. Масс-спектрометрия. Использование в химико-токсикологическом анализе. Сочетание метода масс-спектрометрии с другими методами.

ОСНОВЫ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА

Прибор, осуществляющий измерение отношения массы фрагмента молекулы к его заряду, называется масс-спектрометр. Попадая в него, анализируемые молекулы, последовательно ионизируются, получившиеся в результате этого ионы разделяются в зависимости от присущих им отношений массы к заряду и детектируются. Результатом этих процессов является масс-спектр, который несет в себе информацию о молекулярной массе аналита и его структуре. Таким образом, масс-спектр представляет собой совокупность данных об образующихся при определенных условиях ионизации в результате распада конкретного вещества ионах и их интенсивности.

Характеристический ион — обычно молекулярный ион, присутствие которого в масс-спектре способствует идентификации вещества. 

Масс-спектрометры любого вида обычно работают в двух режимах реги- страции ионов: сканирования или мониторинга характеристических ионов (

Общая схема метода масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия – метод исследования и анализа вещества, основанный на ионизации атомов и молекул, входящих в состав пробы, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов.

1. Превратить нейтральные частицы – атомы или молекулы в частицы заряженные – ионы.

2. Разделить образовавшиеся ионы в пространстве в соответствии с их массой посредством электрического или магнитного поля.

3. Измеряя электрический ток, образуемый направленно движущимися ионами, можно судить об изотопном, атомарном и молекулярном составе анализируемого вещества, как на качественном, так и на количественном уровне.

Оборудование для проведения исследований методом масс- спектрометрии обычно состоит из нескольких основных блоков. 

Вводпробы

Масс-анализатор

Ионныйисточник

Системаоткачки

детектор

Системаобработкиданных

ЭВМ

Блок-схема масс-спектрометра

Методы ионизации вещества

Наиболее старый и наиболее широко применяемый в современной масс- спектрометрии метод электронный удар. 

Другой способ ионизации – это ионизация в ионно-молекулярных реакциях, называемая химической ионизацией. 

Сегодня используются, в основном, методы ионизации при атмосферном давлении – ионизация в электроспрее или – химическая ионизация при атмосферном давлении, а также ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы. В первом случае жидкость вырывается под давлением вместе с коаксиально подаваемым разогретым газом из узкого капилляра с огромной скоростью и прямо в этой струе мелкодисперсного тумана с оболочек молекул срываются электроны, превращая их в ионы. В режиме химической ионизации при атмосферном давлении потенциал прикладывается к электроду в области распыления, что приводит к образованию коронного разряда. В этом случае фрагментация значительно меньше, чем в предыдущем – электроспрее. В методе лазерной десорбции лазерный луч вырывает ионы с поверхности мишени, на которую нанесен образец со специально подобранной матрицей.

17. Иммунологические методы анализа. Применение в химико-токсикологическом анализе.

Иммунохимический анализ (ИХА) – это комплексная методика, которая определяет популяцию клеток, концентрацию сывороточных иммуноглобулинов, циркулирующие иммунные комплексы, параметры лейкоцитов, принимающих участие в фагоцитозе. Его назначают только в крайних случаях, поскольку он дорогостоящий. Но в то же время, результаты этого анализа дают врачу точную картину для понимания возможности организма противостоять различным заболеваниям.

В этот анализ входит проверка количества иммуноглобулинов и репродуктивных гормонов. Гормональная и иммуноферментная диагностика дает возможность понять общее состояние человеческого организма, качество его защитной и репродуктивной функции.

Данный диагностический метод – довольно дорогое удовольствие, но его результаты того стоят. При его помощи специалист может поставить окончательный диагноз даже в самых сложных случаях. Например, благодаря иммуноферментному анализу врач может определить соотношение «антиген-антитело», то есть увидеть количество антител, реагирующих на различные раздражители. Сегодня ИФА считается самым информативным при диагностировании недугов инфекционного характера.

Помимо высокой результативности, ИХА имеет еще одно неоспоримое преимущество – доступность. Практически каждая медицинская лаборатория предоставляет такую услугу. Комплексный анализ назначается в очень редких случаях, поскольку большинству пациентов требуется проверить один или несколько показателей.

Расшифровка результатов

Иммунограмма сложный метод для оценки, ее расшифровка представляет некоторые сложности. Исследование содержит много сложных, взаимосвязанных показателей, которые отражают степень иммунной защиты организма. Иммунограмма содержит большое количество параметров оценки и огромные возможности комплексно оценить все звенья иммунной системы.

Расшифровка результатов исследования состоит из четырех частей.

• изучение Т-клеточной системы – исследование субпопуляций Т-лимфоцитов, изучение лейкоцитарной формулы, клинического анализа крови;

• исследование системы В-лимфоцитов – изучение уровня иммуноглобулинов, количества имуноциркуирующих комплексов;

• анализ системы комплимента – обследуют части и ингибиторы комплимента, интерфероны;

• оценка фагоцитоза – фагоцитарное число, показатели и индексы.

Другие показатели иммунограммы позволяют только уточнять диагноз. Расшифровывать иммунограмму должен только специалист, врач-иммунолог. Он проводит комплексную оценку всех проблем иммунитета.

18. ХТА токсикантов, изолируемых из биологического материала методом минерализации. 

• Используется для изолирования тяжелых металлов.

Различают два вида минерализации: сухую и мокрую

Сухая минерализация

Различают два варианта: 

• Простое сжигание исследуемого материала. 

• Сжигание в присутствии смеси карбоната и нитрата натрия. Наличие нитрата натрия ускоряет процесс. 2NaNO3 = Na2O + 1/2O2 + 2NO2

Используется для биологического материала не содержащего жиров и вещественных доказательств.

Нельзя использовать при подозрении отравления ртутью. При нагревании ртуть улетучивается, что приводит к ее потерям.

Мокрая минерализация-

Нагревание биологического материала со смесью кислот-окислителей (азотной, серной, хлорной).

Выделяют две стадии : 1) деструкция (разрушение связей металл-белок)2) собственно минерализацию (разрушение органической части)

Деструкция-Процесс длится около 30 минут и ведется при нагревании 100-150 градусов. Такие условия позволяют сохранить ртуть в деструктате

Собственно минерализация-Процесс следует за деструкцией и продолжается несколько часов при температуре более 150 градусов. Окончание процесса определяется по просветлению раствора и зависит от содержания жиров в биоматериале.

В минерализате определяются все тяжелые металлы (исключая ртуть).

Метод настаивания с водой в сочетании с диализом-Используется для изолирование из биоматериала неорганических кислот (серной, азотной, хлороводородной) и щелочей (гидроксидов калия и  натрия), а также нитратов и нитритов

Измельченный материал настаивается с водой. Операцию настаивания повторяют для полноты извлечения. Полученный настой отфильтровывают (центрифугируют). Для очистки отвысокомолекулярный соединений используют процесс диализа. 

Метод дистилляции    (перегонки с водяным паром).Используется для изолирования токсикантов представляющих собой газообразные вещества (формальдегид и др.), легколетучие жидкости (ацетон и др.) и легко возгоняемые соединения (фенол и др.).

Измельченный материал помещают в колбу с газоотводной трубкой и заливают подкисленной водой (рН 2). Закрывают  и подсоединяют парообразователь и холодильник. Нагревают парообразователь и колбу с материалом. Образующийся дистиллят собирают в  несколько приемников (с начало легколетучие затем остальные.После окончания отгонки из подкисленного раствора. Материал в колбе подщелачивают (рН 10) и продолжают собирать дистиллят в другой приемник (соединения основного характера). 

Методы изолирования токсикантов основанные на экстракции в сочетании сорбцией. 

Характеристика основных биологических объектов

Основные биологические объекты:МочаКровьСлюнаЖелчьПеченьПочкиТкани мозгаВолосыНогти

Моча – наиболее распространенный объект и простой объект для анализа.Преимущества данного объекта является: 1) может быть получена в достаточном количестве2) концентрация токсикантов и (или) метаболитов как правило высока,3) низкое содержание белков

Так как основная масса токсикантов и их метаболиты содержатся в моче в виде коньюгатов перед экстракцией требуется провести гидролиз (ферментативный или кислотный).Хранение мочи производят в замороженном виде.

Кровь (цельная кровь, плазма, сыворотка).-Для предотвращения свертывания крови используются антикоагулянты.Для уменьшение влияния белков на определение токсикантов производят депротеинизацию.Хранение крови производят в замороженном виде.Слюна – является по составу более простым по составу объектом чем кровь и моча.Существует прямая зависимость между концентрацией токсиканта в крови и слюне.Отбор слюны производится ватным тампоном.Хранение слюны производится в замороженном виде.Желчь – является продуктом деятельности печени, желчного пузыря.Содержит в своем составе желчные кислоты, которые при экстракции образуют стойкие эмульсии.Токсиканты в составе желчи содержатся в виде коньюгатов поэтому перед экстракцией осуществляют предварительный гидролизПечень и почки-В экстрактах из данных органов присутствует как правило много экзогенных и эндогенных веществ, что усложняет процесс извлеченияТкани мозга-Данный объект отличается большим содержанием липидов и холестерола.Перед экстрацией токсикантов необходимо предварительно удалять липиды и холестерол, что требует разрушения комплекса                   липид-жирорастворимый токсикантВолосы-Данный объект доступен для отбора.Способен длительное время сохранять токсикант.Токсиканты в волосах не подвергаются метаболизму.Скорость роста волос постоянна. Возможность оценить время поступления токсиканта. Ногти-Способны задерживать токсиканты. В отличии от волос сохраняют несколько дней.Как и волосах содержание токсикантов составляет нанограммовые количества, что требует использование высокочувствительных методов.Вещественные доказательства (объекты которые оказались не использованы).Учитывается  качественный состав объекта (раствор, таблетки, растительный материал) и содержание токсиканта.

19. Токсико-химическая характеристика соединений мышьяка.

Соли, оксиды и пары мышьяка чрезвычайно опасны.
Вещества содержащие мышьяк: As2O3 – не растворим в воде, соли мышьяковистой кислоты (Na2HAsO4) – растворимые в воде.
В организм человека соединения мышьяка поступают с питьевой и минеральной водой, виноградными винами и соками, морепродуктами, медицинскими препаратами, пестицидами.

Мышьяк, поступающий с пищей, легко всасывается в кровь и быстро выводится в равных количествах с мочой и калом. Мышьяк накапливается в печени, почках, селезенке, легких, стенке пищеварительного тракта. Основное депо мышьяка — эритроциты и селезенка. Мышьяк долго сохраняется в костях и волосах.

Симптомы острого отравления.
При поступлении яда в желудок после начала отравления во рту и зеве ощущаются металлический вкус, царапанье и жжение и сильная, не поддающаяся успокоению рвота при сильнейших болях в животе и во всей брюшной области. Рвотные массы, отчасти желчные, иногда окрашены солями мышьяка в зеленый цвет. Появляются судороги в икрах, цианоз и, наконец, коллапс. При больших дозах на первом плане паралич центральной нервной системы. При остром отравлении мышьяком производят промывание желудка, а в случае поражения почек — гемодиализ. При остром и хроническом отравлении мышьяком применяют унитиол, в качестве антидота.


20.Токсико-химическая характеристика соединений ртути и его соединений, поступление в организм, распределение, превращение, выделение. Изолирование. Качественное и количественное определение. Первая доврачебная помощь.

Отравление ртутью, основные его проявления в качестве профессиональной болезни, описанные Льюисом Кэроллом как “безумие шляпника” и до настоящего времени остаются классическими. Раньше этот металл иногда применялся для серебрения зеркал и производства фетровых шляп. Хлористая ртуть когда-то “популярная” среди самоубийц до сих пор используется в фотогравюрах. В наши дни отравления ртутью редки, но, тем не менее, эта проблема заслуживает внимания. Несколько лет тому назад в г. Минимата (Японии) была зарегистрирована эпидемия отравления ртутью. Ртуть была обнаружена в консервированном тунце, который в качестве пищи употребляли жертвы этого отравления. Маленькие дозы, которые и сейчас обнаруживаются в рыбе, в расчет не принимались, так как в маленьких концентрациях ртуть не аккумулируется. Она выделяется через почки, толстую кишку, желчь, пот и слюну. Между тем ежедневное поступление этих доз может иметь токсические последствия.

Ртуть является высокотоксичным металлом. Ртуть используется в промышленном производстве хлора и NaOH, в электроаппаратуре люминесцентных лампах, фунгицидах и т.д. Применение ртутных соединений в качестве лечебных средств началось в глубокой древности при лечении кожных заболеваний и сифилисе. В современной медицине используется противовоспалительное, антисептическое и дезинфицирующее действие ртути. Ртуть используют в термометрах, манометрах, ртутно-кварцевых лампах и 20 других приборах медицинского назначения. 

Вещества содержащие ртуть: Hg2Cl2(каломель) – растворимая соль ртути, HgCl2(сулема) – нерастворимая соль ртути, HgO, Hg(NO3)2 – растворимая соль ртути, Hg2(NO3)2 – растворимая соль ртути. Производные ртути способны инактивировать энзимы, в частности цитохромоксидазу, принимающую участие в клеточном дыхании. Кроме того, ртуть может соединяться с сульфгидрильными и фосфатными группами и, таким образом, повреждать клеточные мембраны. Токсичность ртути зависит от химической формы, в которой она попадает в организм. Соединения ртути более токсичны, чем сама ртуть. Следует уточнить, что металлическая ртуть, находящаяся, например, в термометрах, сама по себе редко бывает опасной. Лишь ее испарение и вдыхание паров ртути могут привести к развитию фиброза легких. Более того, жидкий металл раньше использовался для лечения упорных запоров, так как его плотность и законы тяжести способствовали мощному терапевтическому эффекту. При этом признаков ртутной интоксикации не наблюдалось. 

Пути проникновения:

1. Пероральный

2. Ингаляционный

3. Перкутанный

4. Парентеральный

Объекты анализа

Пострадавший человек

Трупный материал

моча, кровь, промывные воды желудка, волосы, ногти.

желудок содержимым, кровь, почки, печень, головной мозг.

 

Изолирование

В судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе при исследовании биологического материала (органов трупов, биологических жидкостей и др.) на наличие «металлических» ядов применяется метод минерализации. Для определения ртути в биологическом материале используется деструкция.

При деструкции нагрев происходит до 100 градусов. Для ускорения деструкции к биологическому материалу прибавляют этиловый спирт, который является катализатором этого процесса. Для удаления из деструктата азотной, азотистой кислот и оксидов азота, образующихся в процессе деструкции, прибавляют раствор формальдегида.

Демеркуризация

I. Демеркуризация раствором хлорида железа (III).

 

II. Демеркуризации раствором перманганата калия.

 

Метод демеркуризации, основанный на взаимодействии ртути с раствором FeCl3, считается одним из наиболее простых и надежных. В результате химической реакции мелкие капли ртути превращаются в оксиды и хлориды, более крупные при механическом перемешивании с раствором переходят в мелкодисперсное состояние, что увеличивает их реакционную способность.

Метод основан на взаимодействии ртути со свободным хлором, образующимся при реакции перманганата калия с соляной кислотой. В результате образуется малотоксичная нерастворимая в воде каломель:

 

2KMnO4 + 16HCl = 2KCl + 2MnCI2 + 5Cl2 + 8H20;

2Hg + Cl2 = Hg2Cl2

 

 

Реакция с дитизоном

Для количественного определения катионов металлов в химико-токсикологическом анализе широко используются реакции образования внутрикомплексных соединений. В качестве реактивов для указанной цели часто применяются дитизон.

Атомно-абсорбционная спектрометрия

Атомно-абсорбционная спектрометрия ртутного комплекса использует явление поглощения атомами ртути резонансного излучения.

Многоходовая кювета с эффективной длиной пути 9,6 м обеспечивает высочайшую чувствительность измерений.

Оригинальная схема зеемановской коррекции неселективного поглощения обеспечивает высокую точность измерений независимо от мешающих факторов: пыли, аэрозолей, поглощающих паров и газов.

Элементная ртуть очень хорошо резорбируется в респираторном тракте. Органические соединения ртути (алкилртутные и арилртутные соединения) всасываются в ЖКТ практически полностью, выводятся из организма в основном с калом (80%) и мочой. Максимальная концентрация ртути отмечается в почках. Морфологические изменения при отравлении ртутью наблюдаются там, где наиболее высокая концентрация металла, то есть в полости рта, в желудке, почках и толстой кишке. Кроме того может страдать и нервная система. При хроническом отравлении ртутью развивается синдром меркуриализма с нарушениями деятельности ЦНС и пищеварительного тракта, возникновением дерматозов (меркуриализм кожи). Основные проявления избытка ртути: • психические нарушения: головная боль, утомляемость, тревожность, раздражительность;   •, мозжечковая атаксия, нарушения зрения и слуха, тремор кистей рук, век, губ и всего тела; • ртутная токсикодермия, экзема, выпадение волос, ломкость ногтей; • лабильный пульс, тахикардия, высокая лихорадка; • ртутный стоматит, гингивит, отек, эрозии и язвы слизистой оболочки полости рта, омертвление челюстных отростков, выпадение зубов; • ртутный язвенно-некротический гастроэнтерит, гастралгия, колики, понос, изъязвление и некроз стенки толстой кишки; • расстройства менструального цикла, выкидыши, внутриутробная гибель плода; • изменение состава крови, гемолиз эритроцитов, нарушения кроветворения, анемия с тяжелым течением. Индикаторы экспозиции/интоксикации Приоритетные: содержание ртути в цельной крови, проксимальных (2,5 см) участках волос, суточной моче. Токсическая доза ртути для человека 0,4 мг, летальная доза 150-300 мг. При интоксикации концентрация ртути в цельной крови составляет 0,18— 0,62 мг/мл, в плазме крови — 0,8 мг/л, в моче — 0,09—0,25 мг/л; > 0,15 мг/сут, в печени 2,4—76 мг/кг, в волосах 60—200 мг/кг и более. 

Первая помощь. При приеме внутрь солей ртути необходимо вызвать рвоту. Принимают яичный белок для связывания ртути с белками. Обильное питье. В первые сутки после отравления гемодиализ с одновременным введением раствора унитиола внутривенно. Для лечения отравлений ртутью и ее соединениями используют БАЛ, ДМСК, натриевую соль 2,3- 22 димеркаптопропансульфоновой кислоты (ДМПС), сукцимер.

21.Токсико-химическая характеристика соединений свинца поступление в организм, распределение, превращение, выделение. Изолирование. Качественное и количественное определение. Первая доврачебная помощь.

В настоящее время свинец занимает первое место среди причин промышленных отравлений. Это вызвано широким применением его в различных отраслях промышленности. Воздействию свинца подвергаются рабочие, добывающие свинцовую руду, на свинцово-плавильных заводах, в производстве аккумуляторов, при пайке, в типографиях, при изготовлении хрустального стекла или керамических изделий, этилированного бензина, свинцовых красок и др. При больших концентрациях тетраэтилсвинца возникает риск его проникновения через кожу. 

Некоторые вещества содержащие свинец: PbO, PbSO4, Pb(CH3COO)2, (С2Н5)4Рb (тетраэтилсвинец). Свинец — это остеотропный элемент, замещающий кальций в кристаллах гидроксиаппатита Са10(РО4)6(ОН)2. При поступлении с пищей и водой свинец распределяется в организме животных и человека по скелетному типу. Наиболее высокая концентрация свинца в зубах. Попадая оральным путем, свинец абсорбируется в кишечнике и достигает печени, откуда с желчью вновь попадает в 12-ти перстную кишку. Одна часть свинца реабсорбируется, другая удаляется с испражнениями. Если свинец попадает через дыхательные пути, он быстро достигает кровотока и тогда его действие максимально. Из крови свинец экскретируется почками, часть его депонируется в костях. Свинец ингибирует действие многих энзимов, а также инкорпорацию железа в организме, в результате чего в моче резко увеличивается количество  свободного протопорфирина. Токсическое действие свинца во многом обусловлено его способностью образовывать комплексы с лигандами, содержащими сульфгидрильные и карбоксильные группы, производные имидазола, фосфат-ионы. 

Острое отравление. Острая форма возникает при попадании значительных его доз через желудочно-кишечный тракт. Оно выражается в наступающем через 0,5-1 час сладковатом вкусе во рту, слюнотечении, тошноте, рвоте, судорожных болях в желудке. Хроническое отравление (сатурнизм). Хроническое отравление может развиваться при использовании плохо обоженной керамической посуды, покрытой эмалью, содержащей свинец, при употреблении зараженной воды. Дети в отличие от взрослых гораздо легче абсорбируют свинец. Ранними (хотя и не постоянными) симптомами отравления считаются обычно: свинцовая кайма, свинцовый колорит, определенные изменения в крови и появление гематопорфирина в моче. Свинцовая кайма образуется вследствие отложения в десне свинца, который под влиянием сероводорода, содержащегося в полости рта, превращается в сернистый свинец. Она представляет собою узкую синеватосерую полоску по краю десен, преимущественно у передних зубов. Наиболее резко выраженным и тяжелым симптомом со стороны органов пищеварения является свинцовая колика. Она развивается обычно внезапно и  бурно. Появляются жестокие схваткообразные боли в животе (в подложечной области), во всем животе или преимущественно в правом подреберьи.. Аппетит плохой, нередко рвоты, небольшой стоматит, выделение вязкой слюны. Количество мочи резко падает. В моче могут появляться небольшие количества белка, цилиндров и других форменных элементов. Пульс замедлен (до 50—40 ударов в 1 минуту), напряженный, кровяное давление повышено. Головные боли, бессонница, подавленность, мышечные боли. Отравление свинцом (сатурнизм) – представляет собой пример наиболее частого заболевания, обусловленного воздействием окружающей среды. Органами — мишенями при отравлении свинцом являются кроветворная и нервная системы, почки. Менее значительный ущерб сатурнизм наносит желудочно-кишечному тракту. Один из основных признаков болезни — анемия, возникающая в результате усиленного гемолиза. На уровне нервной системы отмечается поражение головного мозга и периферических нервов. Сатурнизм-обусловленная энцефалопатия чаще наблюдается у детей, реже – у взрослых. В головном мозге выражен диффузный отек серого и белого вещества. Мозговые поражения клинически сопровождаются конвульсиями и бредом, иногда приводят к сонливости и коме. Из периферических нервов чаще всего поражаются наиболее “активные” двигательные нервы мышц. Для хронического сатурнизма характерно развитие хронического гингивита и появление в полости рта темной каемки на десне, так называемой, “свинцовой десны”. Скопление свинца в эпифизарных концах трубчатых костей у детей, имеют характерный вид на рентгенограммах. При интоксикации свинцом применяют хелатирующую терапию (препараты ЭДТА, ДМСК, D-пеницилламин) и восстановленный глутатион. Индикаторы экспозиции/интоксикации Приоритетные: содержание свинца в цельной крови, моче. Токсическая доза свинца для человека 1 мг, летальная доза 10 г. При интоксикации концентрация свинца в цельной крови составляет 0,1-2,28 мг/л, в моче — 0,05-0,08 мг/л, в волосах — более 25 мг/кг.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *